https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276517300370
摘要：
協調的可變剪接事件網絡在發育和疾病中起著至關重要的作用。然而，對調節這些網絡的因素缺乏全面的了解。我們描述了一個高通量系統，用于系統地將反式作用因子與內源性RNA調節事件聯系起來。利用這個系統，我們確定了數百個與不同調控層相關的因子，這些調控層積極或消極地控制與細胞命運相關的AS事件。值得注意的是，超過三分之一的調節因子是轉錄因子。對鋅指蛋白Zfp871和BTB/POZ結構域轉錄因子Nacc1的進一步分析，揭示了它們在控制特異性剪接調節因子表達中的作用，所述轉錄因子分別調節神經和干細胞AS程序。令人驚訝的是，這些蛋白質似乎也通過結合RNA來調節AS。因此，我們的結果揭示了注釋轉錄因子中剪接調節因子的一個巨大的“缺失緩存”，其中一些轉錄因子通過直接和間接機制雙重調節AS。
前言
選擇性剪接是選擇前體基因中不同剪接位點的組合，產生結構和功能不同的基因和蛋白質變體的過程。它廣泛用于擴展后生動物基因組的功能和調節能力。例如，來自人類多外顯子基因的幾乎所有轉錄物都是交替剪接的，并且這些剪接變體的相當大部分以細胞和組織特異性的方式差異表達(潘等人，2008；王等，2008)。As在多種生物過程中具有關鍵作用，包括細胞命運決定，as的失調與許多疾病有關。一個重要的挑戰是理解as事件網絡是如何協調調節的，以在不同的細胞環境中賦予其生物學作用。
AS的時空特異性受順式調控元件和同源反式作用因子的組合控制，它們促進或抑制剪接體的組裝。AS還受與其他調控層的協同相互作用控制，包括轉錄和染色質(Braunschweig等人，2013年)。此外，翻譯后和信號通路通過不同的機制影響AS，例如通過改變關鍵剪接調節因子的功能和/或定位（Heyd和Lynch，2011）。然而，剪接調節器的完整功能以及不同細胞類型的相關機制尚不清楚。這個問題尤其與AS模式相對復雜的細胞類型有關，如胚胎干細胞（ES）和神經細胞。
在AS大規模調查策略的制定方面取得了相當大的進展。基于熒光或熒光素酶的剪接微小基因報告基因已被用于高通量RNA干擾(RNAi)、小分子和cDNA過表達篩選，以發現控制單個AS事件的因子。然而，由于剪接報告子往往不能概括AS調控的重要方面，如與染色質和轉錄成分的干擾，因此需要采用高通量方法來監測內源性AS變化。這方面的進展包括使用高通量定量PCR (qPCR)方法篩選芽殖酵母突變株，用于剪接調節因子，和自動RT-PCR平臺結合毛細管凝膠電泳或測序來監測候選調控因子敲低對凋亡和增殖相關AS事件的影響。這些研究闡明了核心剪接調節因子和輔助剪接調節因子之間有趣而重要的功能關系，以及控制特定as事件的其他因素。
在這項研究中，我們描述了“條形碼測序耦合內源性RNA調控的系統并行分析”(SPAR-seq)，一個多路和定量功能基因組學篩選平臺，與測序輸出相結合，能夠全面地將反式作用因子與數十個感興趣的內源性基因調控事件聯系起來。我們使用SPAR-seq來闡明控制保守的內源性AS事件的調節網絡，這些事件與胚胎干細胞的多能性、神經分化和體細胞重編程有關。我們的結果揭示了數百個之前未知的剪接調控因子與不同的調控層相關，它們影響ES和神經細胞中這些AS事件的不同子集。令人驚訝的是，在神經細胞中，注釋轉錄和dna結合因子影響AS事件的頻率與定義的剪接調控因子相同。對Zfp871和Nacc1的進一步研究表明，這些因子分別直接和間接調控神經網絡和es -細胞-分化AS網絡。因此，本研究介紹了一種用于闡明內源性RNA調控網絡的多功能技術，并強調了其在揭示反式調節因子和相關的多層機制方面的應用，這些調節因子在細胞命運決定中發揮關鍵作用。
結果
一個高通量系統將反式作用因子與內源性AS事件聯系起來
為了系統地發現控制內源性AS網絡影響細胞命運的因素，我們使用SPAR-seq詢問了1536個小干擾RNA (siRNA)敲低和控制治療對52個進化保守的(即在人類和小鼠之間)AS事件的影響，這些事件與ES細胞的多能性，神經分化和體細胞重編程有關。(圖1A;表S1)。在特異性siRNA敲除后，96孔板上的多重RT-PCR同時擴增了52個優先級AS事件。獨特的雙指數條形碼被添加到逆轉錄聚合酶鏈反應擴增子中，以標記每個孔。隨后對條形碼擴增子進行匯集和高通量測序分析，然后將特異性敲除與AS事件的變化聯系起來。
分析的AS事件包括35個盒外顯子，包括8個微外顯子(3 - 27nt)，來自8個具有更復雜AS模式的基因的15個替代外顯子，以及通過基因剪接定位識別的Foxm1中兩個之前未注釋的3’端剪接位點事件。在小鼠ES (CGR8)和神經母細胞瘤(N2A)細胞中進行篩選，以確定AS事件的陽性和陰性調節因子。被敲除的基因包括654個已知的和假定的剪接/RBP相關因子，包括所有注釋的剪接體相關蛋白，以及所有已知的和預測的RNA結合蛋白(rbp)(圖1B;表S2)。我們還詢問了CGR8或N2A細胞中表達的858個與染色質和轉錄相關的注釋基因，其中161個與剪接和RNA結合相關的注釋基因重疊。此外，我們（還發現了）檢測了65個與AS調控相關的信號傳導和翻譯后因子(圖1B;表S2)。
轉染siRNAs后48小時收集總RNA并進行SPAR-seq。設計了一個分析管道來提取數據，通過計算外顯子拼接值（PSI）的百分比來量化AS水平，并使用“嚴格標準化的平均差（SSDM）”對檢測到的AS水平變化（PSI）進行優先排序，以便進一步分析(圖1C；圖S1B和S1C表S3；STAR方法)。SSMD測量效應大小，同時考慮重復之間的差異。總共有316，863個AS測量值通過兩個生物復制篩選進行了分析。SPAR-seq數據還用于監測所有基因的mRNA表達水平，分析剪接變化，以及一組代表性的剪接因子(圖1C；表S4；STAR方法)。這些數據表明進行敲除的所有受監測基因的消耗超過60%(圖S1D)。使用來自CGR8和N2A細胞的獨立樣本進行的逆轉錄聚合酶鏈反應實驗驗證了SPAR-seq檢測到的幾乎所有分析的AS和基因表達事件的變化(圖S1E)。此外，篩選檢測到的PSI變化的幅度與使用獨立逆轉錄聚合酶鏈反應(r = 0.77，n = 335)和RNA測序(RNA-seq) (r = 0.89，n = 224)測量的變化密切相關(圖S1E和S1F)。
陰性對照(32個?siNTs，非靶向siRNA;32模擬控制;24個未處理樣本)一致導致PSI水平幾乎沒有變化，而陽性對照(32個siMbnl，同時下調Mbnl1和Mbnl2)導致許多es細胞差異AS事件向ESlike模式的顯著變化，而沒有顯著影響神經豐富的AS事件，與我們之前的結果一致(圖1D;圖S2A) (Han等，2013)。單個敲除Mbnl蛋白和其他先前與多能性和重編程相關的調節因子，包括Rbfox2、Son、Srsf2、Srsf3和U2af1 ，也影響es -細胞分化AS事件(圖1D;表S3)。相反，在N2A細胞中敲除神經元特異性剪接調節因子nSR100/Srrm4會影響神經豐富的AS事件，而不會顯著影響es -細胞分化的AS事件(圖1D)。其他分析進一步證明了篩選數據的特異性和再現性，無論是在重復實驗中還是在重復實驗之間(圖S2B)。總之，在CGR8和N2A細胞中分別敲除220和416個因子，會導致一個或多個內源性AS事件發生顯著變化(圖1D，柱狀圖)。
相關AS變化揭示了多層調控途徑和復合物
為了研究影響AS的因素之間的功能關系，我們通過CGR8和N2A細胞敲除的所有成對比較來確定52個AS事件的PSI值變化之間的總體相關性。基于兩兩相關相似程度的結果數據聚類顯示了一組因子，這些因子以相似的方式正或負調節AS事件（圖2A和2B；表S5；STAR方法）。與先前的結果一致（Papasaikas等人，2015； Tejedor等人，2015），這些組通常會大量富集在不同生物學過程和途徑中起作用的因子，并且在許多情況下，它們在復合物中相互作用。作為這種方法的補充，我們通過對復雜成員之間的平均成對相關性進行評分，系統地調查了實驗定義的復合物中的因素（來自CORUM； Ruepp等，2010），以協調AS變化（圖3A；表S6）。值得注意的是，在我們的篩選（screen）中至少由三個因素代表的316種復合物中，CGR8中的38種（12％）和N2A細胞中的187種（59％）在篩選以上顯示出顯著的相關性（錯誤發現率[FDR] <0.05，Mann-Whitney U 測試）。 因此，SPAR-seq數據將蛋白質復合物鏈接到與細胞命運相關的AS事件特定亞組的控制，從而提供了對反作用因子之間物理和功能相互作用的了解。
CGR8細胞中最大的相關敲除組之一涉及與17S U2小核核糖核蛋白顆粒（snRNP）相關的因子（圖2A，簇8），其在剪接體形成期間結合前mRNA分支位點（Wahl等人，2009）。顯著的是，相關程度反映了這些成分之間的物理關系（Papasaikas et al。，2015）：七聚體Sm復合體的成員形成一個中央的，高度相關的模塊，與其他（即SF3a / b）U2 snRNP成分相鄰。相比之下，有助于U2 snRNP募集至前mRNA的輔助因子，例如U2af1和U2af2（Wahl等，2009），以及內含子結合復合物（IBC）成分Aqr和Isy1（De等，2015），與核心U2 snRNP蛋白的相關性較低，并形成一個獨特的簇（圖3B）。另一個獨特的子集群包括Rbm17，Cherp，U2surp和Dhx15。 Rbm17通過與U2 snRNP相互作用并在剪接的第二個催化步驟中識別3’個剪接位點AG（Corsini等，2007; Lallena等，2002）來控制剪接位點的選擇，并與U2surp和Dhx15相互作用（Hegele等。 ，2012）。敲除這些因子的相關影響表明，它們可能在調節與細胞命運有關的AS事件的子集中具有密切相關的功能。
有趣的是，U2-snRNP相關因子在胚胎干細胞和重編程細胞中的表達比在分化細胞或組織中的表達更高（圖S3A）（Han等人，2013；Hirsch等人，2015），這些因子的敲除使胚胎干細胞分化的子網絡隨著事件向分化細胞樣模式轉變（圖2A；表S3和S5）。總之，這些結果表明，U2-snRNP相關組分水平的增加可能對維持ES細胞特異性AS模式很重要，而水平的降低則與分化細胞有關。
不同基因調控層在AS控制中的正負作用
在我們的篩選數據中，其他顯著相關的敲除簇包括形成參與剪接的額外亞復合物的因子，但也包括與RNA聚合酶II（pol II）轉錄、染色質修飾、DNA結合/轉錄因子活性、mRNA監測、轉換、轉運和翻譯相關的復合物和途徑，（圖2和3A）。這些簇中的許多因素以前都沒有與剪接控制聯系起來。
其中一個簇包含與外顯子連接復合體（EJC）相關的多種因子，EJC通過無義介導的mRNA衰變（NMD）途徑控制剪接依賴的mRNA輸出和轉換（Tange等人，2004）。敲除“核心”EJC成分（即Eif4a3、Magoh、Rbm8a和Casc3）比敲除“非核心”EJC因子（即Ddx39b、Alyref、Srrm1和Rnps1）對AS模式產生更高的相關性（圖3C）。雖然外周EJC因子Srrm1和Rnps1（兩個因子為EJC非核心成分的因子）已報道在剪接調控中起作用，但目前的數據與核心EJC相關成分也調控AS的新證據一致。此外，我們的結果將這些因素與細胞命運相關的AS事件子集的控制聯系了起來。
我們的數據還揭示了AS的反相關（即拮抗）效應（圖2）。例如，與轉錄/DNA結合活性相關的因子（例如Nfyb、Tbx1和Tfdp1）的敲除（圖2A，簇10）導致Foxm1作為與剪接相關因子子集（例如Snrnp200、Bcas2、Rbfox2和Mbnl蛋白）的敲除負相關的變化（圖2A，簇3）（p<0.01，單側）二項檢驗）。在Arg/Ser重復序列（RS）結構域蛋白和其他因子之間也觀察到拮抗（和正）效應（圖2A，例如簇2和簇5）。例如，敲除先前未鑒定的剪接調節因子精氨酸和富含谷氨酸的1（Arglu1）蛋白和Srsf2對篩選中監測的6（5個？）個（這6個AS事件，為E和s3B圖中的測試的6個因子的AS事件的變化）As事件具有相反的影響（圖3D和3E；圖S3B）。Arglu1以前作為調節因子與雌激素受體介導的基因激活有關。由于RS結構域在剪接組分之間的相互作用中起著中介作用（Lin和Fu，2007），并且由于在我們的篩選中，物理上相關的因子通常具有相關的敲除作用，因此我們詢問Arglu1和Srsf2是否可能通過相互作用相互對抗。在存在核酸酶處理的情況下進行共免疫沉淀，然后對HA-Arglu1和FLAG-Srsf2蛋白質進行western印跡，表明這些蛋白質可以相互作用（圖3F）。因此，這些結果強調Arglu1是一種以前未知的剪接調節因子，可能通過物理拮抗Srsf2發揮作用。
染色質和轉錄因子起AS調節器的作用
在N2A細胞中，染色質/轉錄因子的敲除，包括具有PWWP基序、染色域和各種注釋DNA結合域的蛋白質，其影響頻率與剪接體相關蛋白和具有注釋RNA結合或解旋酶域的附加因子的敲除頻率相似（圖4A和4B；圖S4A）。例如，敲除含有pol-II的復合物的組分，包括核心pol-II亞單位，對As有顯著的和強烈相關的影響，而敲除pol-II起始復合物因子TFIIB和TFIID有不同的影響（圖3A；圖S4B）。因此，AS受到暫時不同的pol-II復合體擾動的差異影響。染色體（SMC）結構維持蛋白的敲除也顯著影響AS（圖3A），這與先前SMC蛋白和剪接因子之間物理和功能聯系的證據一致（McCracken等人，2005）。此外，調控組蛋白修飾的復合物組分（如PTIP-HMT、TLE1輔壓子、含ING4和HBO1復合物）的敲除以及DNA修復（如BLM復合物III和BRCA1BARD1復合物）也顯示出與as顯著相關的作用。有趣的是，含有BRCA1的復合物先前已被證明在DNA損傷時可將剪接因子招募到基因啟動子（Savage et al.，2014）。我們的結果支持BRCA1復合物在AS調節中的作用，并進一步與AS和不同DNA修復途徑之間的聯系起來。
鋅指蛋白在AS調節中的廣泛作用
值得注意的是，篩選數據顯示57%（137/242）的含鋅指（ZnF）結構域的因子敲除影響AS。在這些被分析的C2H2ZNF蛋白中，有42%（49/116）對N2A細胞中的AS有顯著影響（圖4A）。C2H2-ZnF蛋白是最大的一類核酸結合蛋白，包括人類基因組中的718個家族成員和小鼠基因組中的583個成員（Emerson和Thomas，2009；Tadepally等人，2008）。然而，雖然大多數分析的C2H2-ZnF蛋白與DNA結合，并且一個子集已被證明控制轉錄或沉默反轉錄轉座，但這些蛋白質的絕大多數功能尚不清楚（Stubbs等人，2011）。
層次聚類（圖4C）和主成分分析（圖S4C）表明，敲除N2A細胞中的C2H2-ZnF蛋白以正或負的方式影響AS事件的不同亞群。一些最顯著的變化與Gtf3a/TFIIIA、Yy1、Repin1和Rest/Nrsf的敲除有關，所有這些都曾被報道與RNA結合，此外，非神經細胞中神經發生基因的阻遏因子Rest的敲除，使幾個AS事件的剪接模式與Srrm4的敲除方向相反（圖S4C），這與我們先前的發現一致，即Rest轉錄抑制Srrm4，而Srrm4促進神經外顯子的剪接，包括一個沉默靜息活動的外顯子（不懂）。
一個有趣的候選調節因子是Zfp871，它包含一個KRAB結構域和15個C2H2 ZnF結構域。敲除Zfp871以類似于Srrm4的方式影響富含神經的外顯子（圖4C）。此外，對ES細胞向谷氨酸能神經元分化的RNA序列數據的分析（Hubbard等人，2013）表明，Zfp871與Srrm4一樣（Raj等人，2014），在神經元發育過程中表現出顯著的表達增加（圖5A）。為了進一步研究Zfp871的功能及其與Srrm4的關系，我們對敲除N2A細胞中每種蛋白質后的AS和mRNA表達變化進行了RNA-seq分析（圖5B）。敲除Zfp871影響了479個外顯子的剪接（PSI>10），其中189個是神經差異，198個與Srrm4調控的剪接重疊（均p<0.001，Fisher精確檢驗；圖5B）。RT-PCR驗證證實了SPAR-seq和/或RNA-seq檢測到的所有10個分析的Zfp871依賴性和非依賴性神經差異事件的變化（圖5C；圖S5A）。與Srrm4類似（Irimia et al.，2014），敲除Zfp871主要減少短神經差異外顯子的剪接，包括也受Srrm4調控的3-27 nt微酮（圖5B）（p<0.001，Fisher精確檢驗30%nt外顯子與更長外顯子的重疊效應）。此外，受Zfp871敲除影響的AS事件基因在與神經元形態和功能相關的功能類別中顯著富集（圖5D）。
接下來我們研究了Zfp871調節神經分化和/或Srrm4依賴外顯子的機制。與間接作用一致，敲降Zfp871會導致Srrm4 mRNA水平大約降低40%（即最終表達水平為60%），同時也降低了與神經AS相關的其他剪接調節因子的水平，包括Celf4、Raver1、Nova1和Ptbp2（圖5E）。值得注意的是，使用單獨的核苷酸解析交聯和免疫沉淀結合測序（iCLIP），我們觀察到Zfp871優先結合N2A細胞中其調節靶外顯子附近的內含子序列，特別是與促進包涵體的外顯子相鄰的序列（圖5F；圖S5B）。結合占有率的增加并不是由于相應基因的表達增加或結合內含子的保留（數據未顯示）。此外，Zfp871的綁定模式與Srrm4的綁定模式相似，在一個3’端剪接位點上游50個nt區域（Raj等人，2014）。與這一觀察結果一致，Zfp871控制的外顯子兩側是富含UGC基序的序列，它們代表Srrm4的結合位點（圖S5C和S5D）。這些結果表明Zfp871通過影響Srrm4及其靶外顯子的直接和間接機制控制神經AS，并且它還控制不受Srrm4調控的神經外顯子。
Nacc1在多個水平調節ES細胞的分化
分析Zfp871的結果提出了一個有趣的可能性，即在我們的篩選中發現的額外轉錄因子/DNA結合蛋白也可能具有雙重直接和間接AS調節活性。為了研究這一點，我們接下來重點研究了POZ/btbfamily轉錄因子nucleusaccumbernsassociated 1（Nacc1）。從篩選數據來看，Nacc1的敲除與Mbnl和Rbfox2的敲除具有強烈的相關性（圖6A；圖S6A），如前所述，其作為事件負調控ES細胞分化并控制體細胞重編程（Han et al.，2013；Venables et al.，2013）。此外，基因敲除RNA序列分析顯示Nacc1對ES細胞分化有更廣泛的影響，與BNL蛋白的敲除顯著相關（r=0.76，圖6B）。RNA序列數據進一步顯示，Nacc1基因敲除降低了Mbnl1的表達，并在較小程度上降低了其他剪接調節因子的表達，包括Rbfox2（圖6C），盡管在具有AS或敲除后表達變化的基因之間沒有顯著重疊（數據未顯示）。與這些結果一致，對N2A細胞的染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析表明，它與BNL1轉錄起始點的近端結合，但與BNL2或BFOx2基因的近端結合（圖6D；數據未顯示）。類似地，Nacc1峰通常在基因轉錄起始位點附近富集，在Nacc1敲除后表達改變，支持轉錄調節作用（圖S6B）。總的來說，這些數據證明Nacc1通過調節Mbnl1和其他剪接調節因子的表達間接控制ES細胞的分化。
令人驚訝的是，Nacc1還結合其調控靶點周圍的RNA序列作為事件。與Zfp871的結果相似，在N2A細胞中使用iCLIP分析，Nacc1經常與外顯子RNA交聯，但它也在其調節的靶外顯子附近的內含子序列上顯示豐富的占有率（圖6E；圖S6C和S6D）（p<10？5，所有比較，單側Mann-Whitney U檢驗）。利用轉染的野生型和突變體Nacc1構建物進行的交聯免疫沉淀實驗證實，Nacc1結合RNA，并進一步表明該活性主要依賴于位于POZ/BTB和BEN結構域之間的連接區（圖S6E）。這些觀察結果表明，Nacc1在控制ES細胞差異外顯子的內含中起直接作用。
為了證實Nacc1是否對AS有直接的調節作用，我們檢測了細菌表達的重組Nacc1在體外促進報告轉錄物中靶外顯子剪接的活性。Nacc1濃度的增加刺激了Myo9b基因的一個替代外顯子的包含，根據對敲除RNA序列和iCLIP數據的分析，該外顯子受Nacc1調控（圖6F；圖S6F和S6G）。相反，添加可比較水平的重組PTBP1或BSA對剪接水平沒有顯著影響。此外，重組Nacc1不促進神經特異性外顯子的剪接（圖6G）。最后，與其RNA結合活性一致，Nacc1的連接區能夠在體外促進外顯子包含，盡管與全長蛋白質相比活性降低（圖S6H）。然而，該結構域的缺失并未消除Nacc1的剪接刺激活性，表明至少在體外，蛋白質中的多個結構域可能形成促進外顯子包含的相互作用（圖S6H）。總的來說，這些結果證明Nacc1和Zfp871一樣，在調節與細胞命運相關的AS事件中具有間接和直接的雙重作用。
討論
在這項研究中描述的SPAR-seq系統產生了一個高度定量的，基于序列的讀數，用于響應數千個查詢條件的幾十個內源性調控事件。通過應用SPAR-seq發現與小鼠ES和神經細胞相關的控制細胞命運的調控網絡，我們已經確定了與不同基因調控層相關的反式作用因子之間廣泛的正功能和負功能相互關系。在神經細胞中一個意想不到的觀察結果是，注釋轉錄、染色質和DNA結合域蛋白的影響頻率與剪接因子相似，并且這些蛋白因子的一個子集通過直接和間接機制雙重控制與網絡相關的細胞命運。
轉錄和染色質調節因子通過各種機制影響AS，包括隨后影響新生轉錄物中AS的剪接成分的招募，以及通過改變競爭剪接位點暴露動力學控制AS的pol II延伸率（Braunschweig et al.，2013）。我們的結果證明，某些轉錄因子也通過與靶外顯子相鄰的RNA序列結合來調控AS網絡，同時也影響控制相同靶外顯子的剪接調控因子的表達。這些觀察結果補充了越來越多的證據，表明缺乏規范RNA結合域的蛋白質，包括與轉錄和染色質調節相關的蛋白質，可以與RNA相互作用（Baltz等人，2012；Castello等人，2012；G Hendrickson等人，2016；Kwon等人，2013）。
值得注意的是，在我們的篩選分析中，超過50%的ZnF基因被敲除，對AS事件的不同亞群產生了顯著的影響。ZnF蛋白質的特定種類，例如那些擁有CCCH型基序的，包括在RNA結合和調節中具有既定作用的成員（例如，U2AF1和MBNL蛋白質）。相反，雖然C2H2-ZnF蛋白是DNA結合蛋白中最大的一類，但只有很少的一部分蛋白具有這種作用。示例包括Gtf3a/TFIIIA（Layat等人，2013年）、HZF/Znf385a（Iijima等人，2005年）、CTCF（Saldan‘a-Meyer等人，2014年）、YY1（Sigova等人，2015年）和WT1（Hastie，2001年）。我們的結果為這類ZnF蛋白在剪接控制中更廣泛的作用提供了證據。值得注意的是，在脊椎動物進化過程中，這類蛋白質的擴展部分是為了在轉錄調控和抑制快速進化的轉座因子中發揮作用（Stubbs等人，2011），也可能出現調節與哺乳動物大腦等器官進化相關的AS日益復雜的模式（Barbosa-Morais et al.，2012）。
最后，我們證明了DNA結合和轉錄因子在RNA水平上多任務調節AS的范例擴展到了其他類型的蛋白質，如BTB/POZ結構域蛋白Nacc1。在本研究中更詳細地研究了這兩種因子在調節能力上的顯著雙重性，這表明額外的轉錄因子具有協調的調節功能，間接和直接地調節AS（圖7）。SPAR-seq屏幕因此突出了注釋轉錄因子和DNA結合蛋白作為as網絡的先前未知調控因子的緩存，包括那些在細胞命運控制中具有重要作用的調控因子。對本研究中確定的剪接調控因子的進一步探索有助于發現在發育和疾病中起關鍵作用的AS調控機制和網絡。此外，SPAR-seq系統的靈活性為在不同的其他機械和生物環境中實現非調節網絡的全面透明打開了大門。
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