當我們得到差異的探針或者差異的甲基化區域之后，通常都會分析這些差異區域對應的基因是否在特定功能上有富集。在ChAMP中，通過champ.GSEA函數來實現功能富集分析。
用法示例：
myNorm <- champ.norm()
myDMP <- champ.DMP()
myDMR <- champ.DMR()
myGSEA <- champ.GSEA()
在ChAMP中，提供了兩種富集分析的方法:
fisher
gometh
champ.GSEA默認對差異CpG位點和差異甲基化區域對應的基因做富集分析，采用的方式是Fisher exact test， 分析的是Gene Set 來自MSigDB。
富集分析早已經是研究基因功能的常用工具之一了，那么對于甲基化芯片的富集分析和傳統的富集分析有沒有不一樣的地方呢？
Gene Set，叫做基因集合，本質上是一系列具有相同功能的基因構成的集合，比如某一條代謝通路，在該代謝通路中有很多的基因，位于同一條pathway下的基因就構成了一個基因集合。
基因集合中最基本的元素是一個一個的基因，而芯片中，我們直接得到的是差異的探針或者差異的區域，首先需要將探針或者區域映射到基因上，在映射的過程中，我們必須考慮到一個因素，基因和探針之間的關系。大部分的基因具有多個CpG位點，會對應多個探針ID。比如基因A上有50個差異CpG位點，基因B上具有2個CpG位點，很明顯二者是有很大差別的，如果只考慮基因，那么A和B就是相同的，都是差異探針對應的基因。所以需要將基因對應的CpG位點考慮進來，gometh算法將基因覆蓋的CpG位點個數作為基因的長度，用來矯正P值。
GSEA 結果如下：
str(myGSEA)
List of 2
$ DMP:’data.frame’: ? ?666 obs. of ?9 variables:
?..$ Gene_List: Factor w/ 8338 levels “3_5_CYCLIC_NUCLEOTIDE_PHOSPHODIESTERASE_ACTIVITY”,..: 355 822 1359 7228 3732 14 364 350 2564 3656 …
?..$ nList ? ?: num [1:666] 1118 2485 1972 1426 102 …
?..$ nRep ? ? : num [1:666] 1026 2267 1768 1172 98 …
?..$ fRep ? ? : num [1:666] 0.918 0.912 0.897 0.822 0.961 …
?..$ nOVLAP ? : int [1:666] 190 329 268 194 39 251 157 161 28 165 …
?..$ OR ? ? ? : num [1:666] 2.37 1.81 1.88 2.05 6.59 …
?..$ P.value ?: num [1:666] 2.55e-21 4.41e-18 4.35e-17 2.76e-16 4.91e-16 …
?..$ adjPval ?: num [1:666] 2.13e-17 1.84e-14 1.21e-13 5.76e-13 8.18e-13 …
?..$ Genes ? ?: Factor w/ 6617 levels “A2M”,”A2M ACVRL1 ACVR1 IL12RB2 TNFRSF1B IL2RA”,..: 1604 5352 2139 2554 4011 5150 2711 519 2708 6157 …
$ DMR:’data.frame’: ? ?115 obs. of ?9 variables:
?..$ Gene_List: Factor w/ 8338 levels “3_5_CYCLIC_NUCLEOTIDE_PHOSPHODIESTERASE_ACTIVITY”,..: 350 7089 246 2061 355 1206 2564 361 3653 7228 …
?..$ nList ? ?: num [1:115] 1062 148 212 201 1118 …
?..$ nRep ? ? : num [1:115] 964 137 194 183 1026 …
?..$ fRep ? ? : num [1:115] 0.908 0.926 0.915 0.91 0.918 …
?..$ nOVLAP ? : int [1:115] 44 21 23 22 43 22 15 29 19 37 …
?..$ OR ? ? ? : num [1:115] 7.69 25.32 19.04 19.22 6.94 …
?..$ P.value ?: num [1:115] 1.77e-21 4.04e-21 1.99e-20 1.04e-19 1.43e-19 …
?..$ adjPval ?: num [1:115] 1.47e-17 1.69e-17 5.53e-17 2.16e-16 2.39e-16 …
?..$ Genes ? ?: Factor w/ 1432 levels “ADCYAP1”,”ADCYAP1 BOLL VAX1 NKX2-3 PRDM14 DBX1 ALX1 PRRT1 RFX4 HOXD4 TNXB LBX1”,..: 446 985 348 984 239 117 387 1321 39 1294 ..
默認對DMP和DMR對應的基因都是富集分析，所以結果是一個長度為2的列表，第一個列表是DMP富集分析的結果，第二個列表是DMR富集分析的結果，每個富集結果是一個data.frame對象。
每列的含義如下：
*Gene_listMSigDB數據庫中定義的基因集合
nList
每個基因集合包括的基因個數nRep
基因集合的基因與所有輸入的gene list 中overlap的基因個數fRep
overla的基因的比例nOVLAP
位于該基因集合下的基因與輸入的gene list 中overlap的個數OR
費舍爾精確檢驗的odds ratio-
Pvalue
單尾fisher exact test檢驗的p值，具體代碼如下listPV.v_2 <- t(apply(fisher.lm_2,1,function(x) unlist(fisher.test(matrix(x,2,2),alternative=”greater”)[c(1,3)])))
adjPval
多重假設檢驗校正之后的P值，默認采用”BH”方法Genes
gene symbol， 個數和nOVLAP相同
需要注意一點，對于fRep < 0.6 的基因集合，會過濾掉。官方是這樣解釋的 remove lists with less than 60% representation on array。
ChAMP中提供的富集分析并不是我們常說的GO/KEGG 富集分析，有很多的R包，比如clusterProfiler， 都可以用來做GO/KEGG富集分析，但是都不會考慮基因對應的CpG位點個數，這也算是一個小的遺憾。如果要做GO/KEGG 富集分析，同時又要考慮CpG位點個數，就必須考慮`missMethyl`包。
