RIP和RNA pulldown都是研究RNA和蛋白相互作用的經典方法，只是出發點不一樣而已。
RIP，RNA 結合蛋白便宜共沉淀，是從蛋白出發研究蛋白RNA相互作用的技術。就是已知一個蛋白，推測會與你的目的RNA相互作用，用蛋白的抗體做免疫共沉淀，把蛋白結合的RNA富集出來并鑒定目的RNA，以證實蛋白與RNA的相互作用。
RNA pulldown是從RNA出發研究蛋白與RNA相互作用的技術。就是用已知的RNA 去拉蛋白，在做western驗證以證實蛋白與RNA的相互作用。
其實就是要證實蛋白與RNA兩個分子相互作用，分別從蛋白和RNA的角度求證。一般兩個實驗都是陽性才能說明他們相互作用。
近年來lncRNA的研究進展迅猛，各類?lncRNA?被大量發現，lncRNA的研究將是?RNA?基因組研究領域非常熱門的一個方向。小編也正好也在做lncRNA相關的課題，今天就總結一下lncRNA的研究套路和最新研究進展。
??LncRNA基本介紹
LncRNA：long non-coding RNAs是一類長度大于200nt，但不編碼蛋白質的RNAs，廣泛存在于動植物中。它們曾長期被誤認為是遺傳暗物質，但近些年研究證實這類RNAs在生物的生命活動過程中起著重要的調控作用。
特點
1.?長度在200-100,000nt
2.?沒有編碼蛋白質潛能
3.?具有細胞或組織類型特異性
4.?表達量和保守性比mRNA低
5.?部分lncRNA不含有polyA尾巴
6.?部分也會翻譯小肽段
??LncRNA功能及作用形式
功能
1.?結合轉錄因子，干擾其靶基因，從而調控轉錄
2.?作為分子海綿，吸附miRNA
3.?與調節蛋白結合，影響蛋白多聚物的形成
4.?招募染色質修飾因子，改變染色質的修飾水平
5.?與mRNA配對結合，影響翻譯，剪切，mRNA的穩定性(類似miRNA功能)
作用
1.?Co-location，也稱cis作用
2.?共表達,?也稱trans作用
??LncRNA研究基本技術
1.?芯片或測序尋找新的lncRNA
2.?生物信息學分析
3.?lncRNA定位
4.?過表達或敲減功能驗證
5.lncRNA互作機制研究
??LncRNA的生物信息學分析
1.?基本處理
??rRNA比例評估
??基本比對統計，鏈特異數據評估
??Cufflink,stringtie轉錄本組裝
2.?特性分析
??序列，位點保守性分析
??外顯子個數,表達和長度分析
??定量差異分析
3.?新LncRNA鑒定
??與已知lncRNA庫比對過濾
??過濾exon<2,長度<200bp,FPKM<1轉錄本
??CPC,CNCI,phyloCSF編碼潛能預測
??ORF長度過濾
??miRNA前體序列過濾
4.?功能分析
??順和反式靶基因預測
??靶基因功能富集分析
??共表達網絡分析
??LncRNA表達驗證
1.?qRT-PCR驗證
??cDNA質量一定要高，保證沒有基因組DNA的污染
??按變化倍數排序，優先選擇差異變化明顯的lncRNA
??按FPKM或reads count排序，優先選擇表達量高的lncRNA
2.?Northern Blot
??既可以驗證lncRNA的表達豐度又可以驗證序列信息，但精度不如qRT-PCR
3.?cDNA末端快速擴增(RACE)
??確定lncRNA 5’和3’末端序列，進而獲得lncRNA的全長信息
??LncRNA定位驗證
1.?FISH(Fluorescencein Situ Hybridization)驗證其亞細胞定位，因為其亞細胞定位與lncRNA的調控機制和功能相關。
2.?對于已知lncRNA可以通過RNALocate數據庫檢索其亞細胞定位。
??LncRNA功能驗證
1.?功能獲得
構建lncRNA過表達載體，觀察過表達lncRNA后對細胞增殖、凋亡、侵襲等影響。
2.?功能缺失
根據其亞細胞定位選擇合適的敲減方法。有時發現細胞的感染效率很高，但是lncRNA的干擾效率卻很低。因為RNA干擾作用只作用在胞漿內，細胞核中的lncRNA無法起作用，這時一般的siRNA或者shRNA方法可能不適用。
3.?其他敲減方法：CRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點反轉和啟動子缺失等方法。
??非編碼能力驗證
構建含有肽段和lncRNA的質粒，驗證其是否有編碼能力。
??LncRNA互作驗證
1.RIP?（蛋白已知，RNA未知）
RIP（RNA immunoprecipitation）又稱為RNA結合蛋白免疫沉淀技術，相當于RNA的ChIP實驗（染色質免疫沉淀）。
目的：RIP是研究RNA與蛋白相互作用的重要手段，利用RIP可以證明蛋白是否與lncRNA發生相互作用。
原理：利用目的蛋白結合RNA形成沉淀復合物，從沉淀的RNA蛋白復合物中純化RNA，再進行定量或測序檢測。
2.RNA-pull down?（RNA已知，蛋白未知）
目的：RNA pull-down實驗主要用來尋找與目的lncRNA結合的蛋白。
原理：蛋白與生物素標記的RNA孵育結合，富集的蛋白通過SDS-PAGE分離，最后選擇特異性蛋白條帶進行質譜鑒定。
3. EMSA(RNA已知，蛋白已知)
目的：?RNA EMSA是通過凝膠電泳遷移檢測蛋白-RNA互作的一種技術。
原理：標記的RNA探針和蛋白孵育，當蛋白-RNA復合體形成后，利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，來確定RNA結合蛋白的特異性。
??LncRNA研究最新案例和進展
1.?案例-腫瘤
期刊：?Nat Cell Biol (IF=20.06)
Grelet et al. A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumour.?Nat Cell Biol. 2017 Sep;19(9):1105-1115.
LncRNA對腫瘤進展的貢獻以及驅動其表達的調控機制是熱點研究領域。PNUTS基因的pre-RNA在不同條件下能剪切成兩種產物：lncRNA-PNUTS和正常mRNA-PNUTS,兩種分子在腫瘤中發揮著不同作用，此研究詳細的揭示其產生的剪切機制及兩種分子的功能機制。
點評：實驗機制王道文章
2.?案例-CRISPR-Cas9
期刊：Nature (IF=40.137)
Joung et al. Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature. 2017 Aug 17;548(7667):343-346
哺乳動物基因組包含數萬個長鏈非編碼RNA的基因座，其中一些已被發現在生命過程中發揮重要作用。但確定這些lncRNA的功能和機制仍具有挑戰性。作者開發了基于全基因組規模的CRISPR-Cas9激活篩選系統，可以靶向超過10,000個lncRNA轉錄起始位點，用于識別影響感興趣表型的lncRNA?。通過此技術發現有11個lncRNAs在募集活化因子后介導人類黑素瘤細胞BRAF抑制劑的抗性。
點評：從組學高通量篩選到功能高通量篩選的標桿文章
3.?案例-單細胞核測序
期刊：Nat Commun (IF=12.124)
See K, et al. Single cardiomyocyte nuclear transcriptomes reveal a lincRNA-regulated de-differentiation and cell cycle stress-response in vivo. Nat Commun. 2017 Aug 9;8(1):225
此研究通過對來自小鼠和人衰竭的心肌細胞以及正常的成年心臟的單細胞核RNA測序，發現了心肌細胞亞群上調細胞周期激活等因子并且證明了抑制因子是由體內應激反應所引起的。通過加權基因共表達網絡分析來表征這些亞組，并發現一些起關鍵調節因子的lncRNA。
點評：單細胞測序技術和LncRNA研究兩熱點結合文章
希望本篇總結能給對lncRNA研究感興趣的小伙伴們一點幫助，同時如果有lncRNA生信分析或實驗方面的問題，可以通過微信生信草堂交流群進行交流哦。
