轉自：https://blog.csdn.net/sinat_38163598/article/details/72910115
samtools是一個用于操作sam和bam文件（通常是短序列比對工具 bwa,bowtie2,hisat2,tophat2等等產生的，具體格式可以在消息框輸入“SAM”查看）的工具合集，包含有許多命令。以下是常用命令的介紹。
1.View
view命令的主要功能是：將sam文件與bam文件互換；然后對bam文件進行各種操作，比如數據的排序(sort)和提取(這些操作
是對bam文件進行的，因而當輸入為sam文件的時候，不能進行該操作)；最后將排序或提取得到的數據輸出為bam或sam（默認的）格式。
bam文件優點：bam文件為二進制文件，占用的磁盤空間比sam文本文件??；利用bam二進制文件的運算速度快。
view命令中，對sam文件頭部（序列ID）的輸入(-t或-T）和輸出(-h)是單獨的一些參數來控制的。
Usage: samtools view [options] | [region1 [...]]
默認情況下不加 region，則是輸出所有的 region.
options:
-b?output?BAM
??默認下輸出是?SAM?格式文件，該參數設置輸出?BAM?格式
?-h?print?header?for?the?SAM?output
??默認下輸出的?sam?格式文件不帶?header，該參數設定輸出sam文件時帶?header?信息
?-H?print?header?only?(no?alignments)
??僅僅輸出文件的頭
?-S?input?is?SAM
??默認下輸入是?BAM?文件，若是輸入是?SAM?文件，則最好加該參數，否則有時候會報錯。
?-u?uncompressed?BAM?output?(force?-b)
??該參數的使用需要有-b參數，能節約時間，但是需要更多磁盤空間。
?-c?Instead?of?printing?the?alignments,?only?count?them?and?print?the?
??total?number.?All?filter?options,?such?as?‘-f’,?‘-F’?and?‘-q’?,???are?taken?into?account.
??過濾功統計功能
?-c?print?only?the?count?of?matching?records
?-L?FILE??output?alignments?overlapping?the?input?BED?FILE?[null]
?-t?FILE??list?of?reference?names?and?lengths?(force?-S)?[null]
??使用一個list文件來作為header的輸入
?-T?FILE??reference?sequence?file?(force?-S)?[null]
??使用序列fasta文件作為header的輸入
?-o?FILE??output?file?name?[stdout]
?-F?INT???filtering?flag,?0?for?unset?[0]?
??Skip?alignments?with?bits?present?in?INT?[0]
??數字4代表該序列沒有比對到參考序列上
??數字8代表該序列的mate序列沒有比對到參考序列上
??過濾功能。如F12過濾只有雙端map的
?-q?INT???minimum?mapping?quality?[0]
????比對的最低質量值，一般認為20就為unique比對了，可以結合上述-bF參數使用使用提取特定的比對結果
例子：
將sam文件轉換成bam文件
samtools view -bS abc.sam > abc.bam
BAM轉換為SAM
samtools view -h -o out.sam out.bam
提取比對到參考序列上的比對結果
samtools view -bF 4 abc.bam > abc.F.bam
提取paired reads中兩條reads都比對到參考序列上的比對結果，只需要把兩個4+8的值12作為過濾參數即可
samtools view -bF 12 abc.bam > abc.F12.bam
提取沒有比對到參考序列上的比對結果
samtools view -bf 4 abc.bam > abc.f.bam
提取bam文件中比對到caffold1上的比對結果，并保存到sam文件格式
samtools view abc.bam scaffold1 > scaffold1.sam
提取scaffold1上能比對到30k到100k區域的比對結果
samtools view abc.bam scaffold1:30000-100000 $gt; scaffold1_30k-100k.sam
根據fasta文件，將 header 加入到 sam 或 bam 文件中
samtools view -T genome.fasta -h scaffold1.sam > scaffold1.h.sam
2.Sort
sort對bam文件進行排序。一些軟件需要sort的bam或者sam文件，如stringtie，所以必須要sort使用；求depth時，也必須要sort；
Usage: samtools sort [-n] [-m ] ?
-m 內存參數默認下是 500,000,000 即500M（不支持K，M，G等縮寫）。對于處理大數據時，如果內存夠用，則設置大點的值，以節約時間。
-n 設定排序方式按short reads的ID排序。默認下是按序列在fasta文件中的順序（即header）和序列從左往右的位點排序。
例子：
samtools sort accept.bam accept.sort最終產生accept.sort.bam
3.merge
將2個或2個以上的已經sort了的bam文件融合成一個bam文件。融合后的文件已經sort過了的。
Usage:? samtools merge [-nr] [-h inh.sam] [...]Options: -n? ? ? sort by read names? ? ? ? -r? ? ? attach RG tag (inferred from file names)? ? ? ? -u? ? ? uncompressed BAM output? ? ? ? -f? ? ? overwrite the output BAM if exist? ? ? ? -1? ? ? compress level 1? ? ? ? -R STR? merge file in the specified region STR [all]? ? ? ? -h FILE? copy the header in FILE to [in1.bam]
例子：
4.index
必須對bam文件進行默認情況下的排序后，才能進行index。否則會報錯。
建立索引后將產生后綴為.bai的文件，用于快速的隨機處理。很多情況下需要有bai文件的存在，特別是顯示序列比對情況下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2顯示reads的比對圖形的時候也需要。IGV顯示比對情況也需要。
Usage: samtools index [out.index]
例子：
以下兩種命令結果一樣
$ samtools index abc.sort.bam$ samtools index abc.sort.bam abc.sort.bam.bai
5.faidx
對fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai后綴結尾。該命令也能依據索引文件快速提取fasta文件中的某一條（子）序列
Usage: samtools faidx [ [...]]對基因組文件建立索引，方便提取序列。
例子：$ samtools faidx genome.fasta
由于有索引文件，可以使用以下命令很快從基因組中提取到fasta格式的子序列
$ samtools faidx genome.fasta scffold_10 > scaffold_10.fasta
6.tview
tview能直觀的顯示出reads比對基因組的情況，和基因組瀏覽器有點類似。
需要事先利用利用上面講的sort和建index命令執行完后，用下述命令。
Usage: samtools tview [ref.fasta]
出參考基因組的時候，會在第一排顯示參考基因組的序列，否則，第一排全用N表示。按下 g ，則提示輸入要到達基因組的某一個位點。例子“scaffold_10:1000"表示到達第10號scaffold的第1000個堿基位點處。使用H(左）J（上）K（下）L（右）移動顯示界面。大寫字母移動快，小寫字母移動慢。使用空格建向左快速移動（和 L 類似），使用Backspace鍵向左快速移動（和 H 類似）。Ctrl+H 向左移動1kb堿基距離； Ctrl+L 向右移動1kb堿基距離可以用顏色標注比對質量，堿基質量，核苷酸等。30～40的堿基質量或比對質量使用白色表示；20～30黃色；10～20綠色；0～10藍色。使用點號'.'切換顯示堿基和點號；使用r切換顯示read name等還有很多其它的使用說明，具體按 ？ 鍵來查看。
7.flagstat
給出BAM文件的比對結果
Usage: samtools flagstat
$ samtools flagstat example.bam
11945742 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
#總共的reads數
0 + 0 duplicates
7536364 + 0 mapped (63.09%:-nan%)
#總體上reads的匹配率
11945742 + 0 paired in sequencing
#有多少reads是屬于paired reads
5972871 + 0 read1
#reads1中的reads數
5972871 + 0 read2
#reads2中的reads數
6412042 + 0 properly paired (53.68%:-nan%)
#完美匹配的reads數：比對到同一條參考序列，并且兩條reads之間的距離符合設置的閾值
6899708 + 0 with itself and mate mapped
#paired reads中兩條都比對到參考序列上的reads數
636656 + 0 singletons (5.33%:-nan%)
#單獨一條匹配到參考序列上的reads數，和上一個相加，則是總的匹配上的reads數。
469868 + 0 with mate mapped to a different chr
#paired reads中兩條分別比對到兩條不同的參考序列的reads數
243047 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
#同上一個，只是其中比對質量>=5的reads的數量
8.depth
得到每個堿基位點的測序深度,并輸出到標準輸出，所以要用大于號追加到一個文件。
Usage: bam2depth [-r reg] [-q baseQthres] [-Q mapQthres] [-b in.bed] [...]
-r 后面跟染色體號（region）
-q ：計算深度時要求測序堿基質量最低質量值
-Q：計算深度時要求比對的最低質量值
注意：做depth之前必須做samtools index；
例子
samtools depth accept.bam >depth
9.其他命令
reheader：替換bam文件的頭
$ samtools reheader
idxstats ：統計一個表格，4列，分別為”序列名，序列長度，比對上的reads數，unmapped reads
number。第4列應該是paired
reads中有一端能匹配到該scaffold上，而另外一端不匹配到任何scaffolds上的reads數。
$ samtools idxstats
rmdup：將由PCR duplicates獲得的reads去掉，并只保留最高比對質量的read。
Usage: ?samtools rmdup [-sS]
-s 對single-end reads。默認情況下，只對paired-end reads-S 將Paired-end reads作為single-end reads處理。
10. 將bam文件轉換為fastq文件
有時候，我們需要提取出比對到一段參考序列的reads，進行小范圍的分析，以利于debug等。這時需要將bam或sam文件轉換為fastq格式。
該網站提供了一個bam轉換為fastq的程序：http://www.hudsonalpha.org/gsl/information/software/bam2fastq
$ wget http://www.hudsonalpha.org/gsl/static/software/bam2fastq-1.1.0.tgz$ tar zxf bam2fastq-1.1.0.tgz$ cd bam2fastq-1.1.0$ make$ ./bam2fastq
11. mpileup
samtools還有個非常重要的命令mpileup，以前為pileup。該命令用于生成bcf文件，再使用bcftools進行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附帶的軟件，在samtools的安裝文件夾中可以找到。
最常用的參數有2：
?-f 來輸入有索引文件的fasta參考序列； -g 輸出到bcf格式。用法和最簡單的例子如下
Usage: samtools mpileup [-EBug] [-CcapQcoef] [-rreg] [-fin.fa] [-llist] [-McapMapQ] [-QminBaseQ] [-qminMapQ]in.bam[in2.bam[...]]$ samtools mpileup -f genome.fasta abc.bam > abc.txt
$ samtools mpileup -gSDf genome.fasta abc.bam > abc.bcf
$ samtools mpileup -guSDf genome.fasta abc.bam | \
? ? ? ? ? bcftools view -cvNg - > abc.vcf
mpileup不使用-u或-g參數時，則不生成二進制的bcf文件，而生成一個文本文件(輸出到標準輸出)。該文本文件統計了參考序列中每個堿基位點的比對情況；該文件每一行代表了參考序列中某一個堿基位點的比對結果。比如：
scaffold_1????? 2841??? A?????? 11????? ,,,...,....???? BHIGDGIJ?FF
scaffold_1????? 2842??? C?????? 12????? ,$,,...,....^I. CFGEGEGGCFF+
scaffold_1????? 2843??? G?????? 11????? ,,...,.....???? FDDDDCD?DD+
scaffold_1????? 2844??? G?????? 11????? ,,...,.....???? FA?AAAA
scaffold_1????? 2845??? G?????? 11????? ,,...,.....???? F656666166*
scaffold_1????? 2846??? A?????? 11????? ,,...,.....???? (1.1111)11*
scaffold_1????? 2847??? A?????? 11????? ,,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAT.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG?????? %.+....-..)
scaffold_1????? 2848??? N?????? 11????? agGGGgGGGGG???? !!$!!!!!!!!
scaffold_1????? 2849??? A?????? 11????? c$,...,.....??? !0000000000
scaffold_1????? 2850??? A?????? 10????? ,...,.....????? 353333333
mpileup生成的結果包含6行：參考序列名；位置；參考堿基；比對上的reads數；比對情況；比對上的堿基的質量。其中第5列比較復雜,解釋如下：
1 ‘.’代表與參考序列正鏈匹配。
2 ‘,’代表與參考序列負鏈匹配。
3 ‘ATCGN’代表在正鏈上的不匹配。
4 ‘atcgn’代表在負鏈上的不匹配。
5 ‘*’代表模糊堿基
6 ‘^’代表匹配的堿基是一個read的開始；’^'后面緊跟的ascii碼減去33代表比對質量；這兩個符號修飾的是后面的堿基，其后緊跟的堿基(.,ATCGatcgNn)代表該read的第一個堿基。
7 ‘$’代表一個read的結束，該符號修飾的是其前面的堿基。
8 正則式’\+[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在該位點后插入的堿基；比如上例中在scaffold_1的2847后插入了9個長度的堿基acggtgaag。表明此處極可能是indel。
9 正則式’-[0-9]+[ACGTNacgtn]+’代表在該位點后缺失的堿基；
12. 使用bcftools
bcftools和samtools類似，用于處理vcf(variant call format)文件和bcf(binary call format)文件。前者為文本文件，后者為其二進制文件。
bcftools使用簡單，最主要的命令是view命令，其次還有index和cat等命令。index和cat命令和samtools中類似。此處主講使用view命令來進行SNP和Indel calling。該命令的使用方法和例子為：
$ bcftools view [-AbFGNQSucgv] [-DseqDict] [-llistLoci] [-slistSample] ? ? ? ? ? [-igapSNPratio] [-tmutRate] [-pvarThres] [-Pprior] ? ? ? ? ? [-1nGroup1] [-dminFrac] [-UnPerm] [-XpermThres] ? ? ? ? ? [-TtrioType]in.bcf[region]
$ bcftools view -cvNg abc.bcf > snp_indel.vcf
生成的結果文件為vcf格式，有10列，分別是：1 參考序列名；2 varianti所在的left-most位置；3 variant的ID（默認未設置，用’.'表示)；4 參考序列的allele；5 variant的allele(有多個alleles，則用’,'分隔);6 variant/reference QUALity;7 FILTers applied;8 variant的信息，使用分號隔開；9 FORMAT of the genotype fields, separated by colon (optional)； 10 SAMPLE genotypes and per-sample information (optional)。
例如：
scaffold_1? ? ? 2847? ? .? ? ? A? ? ? AACGGTGAAG? ? ? 194? ? .? ? ? INDEL;DP=11;VDB=0.0401;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,8,3;MQ=35;FQ=-67.5? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:235,33,0:63
scaffold_1? ? ? 3908? ? .? ? ? G? ? ? A? ? ? 111? ? .? ? ? DP=13;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,7;MQ=42;FQ=-63? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:144,36,0:69
scaffold_1? ? ? 4500? ? .? ? ? A? ? ? G? ? ? 31.5? ? .? ? ? DP=8;VDB=0.0034;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,3;MQ=42;FQ=-39? ? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:64,12,0:21
scaffold_1? ? ? 4581? ? .? ? ? TGGNGG? TGG? ? 145? ? .? ? ? INDEL;DP=8;VDB=0.0308;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,0,8;MQ=42;FQ=-58.5? ? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:186,24,0:45
scaffold_1? ? ? 4644? ? .? ? ? G? ? ? A? ? ? 195? ? .? ? ? DP=21;VDB=0.0198;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,10,10;MQ=42;FQ=-87 GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:228,60,0:99
scaffold_1? ? ? 4827? ? .? ? ? NACAAAGA? ? ? ? NA? ? ? 4.42? ? .? ? ? INDEL;DP=1;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,0;MQ=40;FQ=-37.5? ? ? GT:PL:GQ? ? ? ? 0/1:40,3,0:3
scaffold_1? ? ? 4854? ? .? ? ? A? ? ? G? ? ? 48? ? ? .? ? ? DP=6;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,2,1;MQ=41;FQ=-36? ? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:80,9,0:16
scaffold_1? ? ? 5120? ? .? ? ? A? ? ? G? ? ? 85? ? ? .? ? ? DP=8;VDB=0.0355;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,3;MQ=42;FQ=-51? ? GT:PL:GQ? ? ? ? 1/1:118,24,0:45
第8列中顯示了對variants的信息描述，比較重要，其中的 Tag 的描述如下：
Tag Format Description
AF1 double Max-likelihood estimate of the site allele frequency (AF) of the first ALT allele
DP int Raw read depth (without quality filtering)
DP4 int[4] # high-quality reference forward bases, ref reverse, alternate for and alt rev bases
FQ int Consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwise
MQ int Root-Mean-Square mapping quality of covering reads
PC2 int[2] Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2
PCHI2 double Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samples
PV4 double[4] P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias
QCHI2 int Phred-scaled PCHI2
RP int # permutations yielding a smaller PCHI2
CLR int Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraint
UGT string Most probable genotype configuration without the trio constraint
CGT string Most probable configuration with the trio constraint
使用bcftools得到variant calling結果后。需要對結果再次進行過濾。主要依據比對結果中第8列信息。其中的 DP4
一行尤為重要，提供了4個數據：1 比對結果和正鏈一致的reads數、2 比對結果和負鏈一致的reads數、3
比對結果在正鏈的variant上的reads數、4 比對結果在負鏈的variant上的reads數?？梢栽O定 （value3 +
value4）大于某一閾值，才算是variant。比如：
$ perl -ne 'print $_ if /DP4=(\d+),(\d+),(\d+),(\d+)/ && ($3+$4)>=10 && ($3+$4)/($1+$2+$3+$4)>=0.8' snp_indel.vcf > snp_indel.final.vcf
