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驗證基因已成功克隆的方法
接近克隆工作流程完畢的時候。 將DNA片段連接到選擇的載體中并轉化到大腸桿菌細胞中。 將經過轉化后的細胞轉移到選擇性培養基，倒置培養過夜，獲得大量菌落。?
如何才能確保重組克隆的準確性呢？ 在確定克隆成功之前，需要對重組克隆進行篩選和鑒定。下面列出的是5種最常用的方法。
1.藍白篩選法
藍白篩選法，又叫β-半乳糖苷酶顯色法，廣泛用于檢查克隆是否成功。在該方法中，將外源DNA克隆到含有編碼α-半乳糖苷酶功能性亞基的lacZα序列的載體中。多克隆位點位于lacZα序列內。
該質粒必須轉化成具有lacZΔM15突變的特定大腸桿菌菌株。由于α-肽（β-半乳糖苷酶）的活性保持完整，空載體會產生藍色菌落。
篩選板中提供的無色X-gal（乳糖類似物）被β-半乳糖苷酶水解形成藍色顏料（5,5'-二溴-4,4'-二氯 - 靛藍）。如果載體含有破壞lacZα序列的DNA插入片段，則α肽不會被表達，X-gal也不會被水解。因此，如果存在外源DNA，則菌落將是白色的。
該實驗有可能出現假陽性（沒有外源DNA的白色菌落），因此建議對白色菌落進一步確認。
2.正向選擇向量
簡化篩選的有效方法是使用正向選擇向量。陽性選擇載體有條件地表達致死基因，例如消化細菌宿主的基因組DNA的限制酶。
通過將DNA插入片段連接到克隆位點來破壞致死基因的表達。結果，只有具有重組質粒的細胞才能生長。
這種方法可以節省時間和成本，因為它通常會產生> 99％的重組克隆。 Thermo Scientific CloneJET PCR克隆試劑盒采用陽性克隆選擇方法。
3.限制酶酶切法
還可以進行限制酶消化以確定正確的插入片段。首先，使用質粒小量制備試劑盒（如Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep試劑盒）從過夜細菌培養物中分離質粒DNA。
我們的REsearch限制性位點映射工具可用于確定給定序列中的限制性位點。選擇限制性內切酶，可以讓您輕松確定質粒是否含有插入片段。然后，用限制性內切酶從重組克隆中消化純化的質粒DNA。
為了獲得快速的結果，我們推薦Thermo Scientific?FastDigest?限制酶。在瓊脂糖凝膠上運行消化的質粒，驗證載體骨架和插入片段是否具有預期的大小。
4.菌落PCR
也可以使用PCR篩選細菌菌落的方法來確定DNA插入物的存在。引物可以是插入特異性的，載體特異性的或兩者以檢測插入物。
為了確定插入物的方向，推薦使用載體特異性和插入特異性引物的組合。通過PCR進行的菌落篩選適用于短于3kb的插入片段。
使用Thermo Scientific?PCR試劑可以將單個菌落直接接入PCR主混合物。菌落的剩余部分可以用于接種培養平板或含適當抗生素的液體LB培養基用于下游應用。
5.測序
驗證重組菌落最準確的方法事測序。首先從過夜細菌培養物中分離質粒DNA。插入片段可以使用適合于載體的測序引物通過Sanger測序來鑒定。需要對整個插入片段進行測序以驗證插入的確切順序。
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