最近在進(jìn)行ac4C-seq數(shù)據(jù)分析時，從GEO上下載了Cell文章“Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency”的原始數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)GSM2724031這個原始文件的Q30竟然是100%。于是總結(jié)下，供大家參考。
1，GEO數(shù)據(jù)庫簡介
1，芯片，測序原始數(shù)據(jù)倉庫?；蚪M，轉(zhuǎn)錄組，修飾等，但是不存蛋白質(zhì)譜和代謝數(shù)據(jù)
2，發(fā)文章一般都要上傳原始數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，真實(shí)性
3，大量數(shù)據(jù)共享，可挖掘發(fā)文章：沒有數(shù)據(jù)，挖掘GEO；數(shù)據(jù)不夠，GEO來湊
4，數(shù)據(jù)質(zhì)量參差不齊，需要自行甄別
2，Illumina測序儀下機(jī)Fastq原始數(shù)據(jù)格式
3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)Q計(jì)算方法
Q=?10 log10(P)
P是堿基識別的錯誤概率，來自堿基識別算法（base calling algorithm）并依賴于多少信號被捕獲。
Q30值一般用百分比展示，表示Q值大于30的堿基比例。例如Q30=85.75%表示這個（或者雙端時R1+R2）fastq文件的全部total個堿基中，有total*0.8575個堿基的Q值都大于30。所以Q30是衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量的一個很重要的標(biāo)準(zhǔn)。Illumina官方以80%為閾值，實(shí)際中一般可以做到95%，甚至更高。雖然理論上Q30可以是100%，但是目前還做不到。
4，測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)為什么越往后越差？
Illumina測序技術(shù)基于邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）的原理，利用DNA聚合酶在模板DNA上逐個添加熒光標(biāo)記的dNTP，從而實(shí)現(xiàn)對DNA序列的測定。在測序初期，由于合成反應(yīng)尚未完全穩(wěn)定，因此雖然DNA聚合酶的活性較高，但在高質(zhì)量區(qū)域（通常指測序的前1-30個堿基對）內(nèi)可能會出現(xiàn)一定的波動。隨著測序的進(jìn)行，合成反應(yīng)逐漸穩(wěn)定，但隨著時間的推移，DNA聚合酶的活性會逐漸降低，導(dǎo)致特異性下降，從而增加了后續(xù)測序過程中出錯的概率。
在Illumina測序中，隨著DNA聚合酶活性的降低，測序錯誤率也會隨之升高，這可能是由于聚合酶保真度降低以及二代測序固有的特點(diǎn)導(dǎo)致的。
5，GEO和SRA的區(qū)別
GEO最開始是存儲的芯片數(shù)據(jù)，包括芯片原始文件，處理過的表格等。后來測序出來后，GEO也開始存儲測序的數(shù)據(jù)，再后來由于原始數(shù)據(jù)越來越多，越來越大，為了區(qū)分就又重開了個存儲測序原始數(shù)據(jù)的SRA。上傳到GEO的原始fastq也會隨后存到SRA里邊。所以，對用戶來說，區(qū)別就是數(shù)據(jù)上傳到SRA時，可以不用上傳processed data，而上傳到GEO時，必需上傳processed data。
GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)包括Platform（GPL）、Sample（GSM）、Series（GSE）和Dataset（GDS）。GSE通常指代一個研究項(xiàng)目，GSM是單個樣本的數(shù)據(jù)，而GDS是整理后的數(shù)據(jù)分析集。
SRA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)包括Studies（ERP/SRP）、Experiments（SRX）、Samples（SRS）和Runs（SRR）。Studies代表研究課題，Experiments代表實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Samples代表樣本信息，而Runs代表測序結(jié)果集
6，GEO/SRA對原始fastq的處理
原始下機(jī)fastq文件在上傳GEO/SRA后，工作人員會對其進(jìn)行處理，將每條read的測序儀相關(guān)信息（read name）去掉，替換成諸如1、2、3，或者是SRR123456.1，SRR123456.2這種序列編號（2018年前的可能會保留read name信息）。
7，GEO/SRA原始fastq下載
一般直接使用sratoolkit來下載。命令為：
prefetch -X 200G SRR123456 -o SRR123456
fastq-dump --split-files -F SRR123456
8，GEO/SRA的fastq文件都是原始下機(jī)數(shù)據(jù)嗎？
一般是原始下機(jī)數(shù)據(jù)（read長度完全一樣），但是也有去接頭之后的clean數(shù)據(jù)（長度不一樣）。
我們來看看GSM2724031的原始文件，下載后，轉(zhuǎn)成fastq文件。
發(fā)現(xiàn)這個fastq的質(zhì)量分?jǐn)?shù)全是?，而其他原始數(shù)據(jù)不存在這個問題，推測GSM2724031樣品的原始fastq文件在上傳GEO前，fastq里邊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)被人為替換了，替換的原因就無從知曉了，也許“這世界就是個巨大的草臺班子”。
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