1.Meta分析通過增加數據量是否可以組裝出低豐度物種？?

在Metagenome 中，高豐度物種和低豐度物種分布的具有不均勻性，物種的多樣性會對組裝過程造成困難，組裝時若高豐度和低豐度物種差異太大，會把低豐度物種所屬的kmer 作為分支也剪切掉，這時會造成低豐度的物種難以組裝出來，這也是現在宏基因組研究中的一個難點。隨著測序深度的增加，對于低豐度物種的組裝能否有利，需要看該物種的具體的豐度情況，若豐度太低，即使增加數據量，也不一定能夠組裝出來。

2.為什么樣品有污染的情況下組裝結果會相對較差？?

由于組裝軟件在組裝過程中是將測序數據看作來自同一個基因組的前提下進行的，如果樣品有外源DNA混雜，其中不同來源的DNA中會有不同程度的相似性序列和非相似性序列，這些復雜的關系會對組裝軟件產生干擾，而軟件為保證組裝的準確性，只能將可疑的部分切斷成不同的碎片序列，而這也導致最終的組裝只能拿到碎片化的序列，而失去了組裝本身想要達到的效果。

3.宏基因組測序可以得到樣本的完整序列么？

宏基因組二代測序長度約為?350bp 的片段，經過預處理后得到 Clean Data，進行組裝分析得到scaftigs去冗余后的代表序列進行基因預測的到UniGene,使用Unigene進行后續的功能預測和物種注釋，所以無法得到完整序列。

4?樣品去宿主為什么要進行最大值均一化？

對于生物類樣本，由于宏基因組測序過程中無法消除宿主序列的影響，部分樣本的測序結果中可能會包含較多的宿主序列，去除宿主后序列損失較多。若采用最小值均一化，可能會導致其他樣本有效序列大量損失，尤其是低豐度物種。

5.做基因預測的時候為什么使用cds序列與clean去比對，而不與scaftig序列去比對？

因為組裝的形式得到scaftig是為了保證預測數據的準確性，反映了原始序列的真實組成情況，而我們的基因預測豐度計算既涉及到了測序的深度，又涉及到了序列的程度，clean序列含有多條重復片段，增加了測序的深度，體現在了量的反饋上，因此使用clean去比對能反饋數據豐度的真實情況。

6.如何根據結果中生成的CDS或者蛋白質的序列找到其相所屬的物種的序列。

宏基因組測序實際是對復雜環境樣本的微生物構成進行分析，由于測序深度和環境復雜度的影響，無法對樣本的某種微生物基因組進行組裝；所以CDS無法與具體的某個來源物種的DNA 序列進行對應。?

7.真菌注釋信息較少的原因是什么？

1）樣本中真菌豐度低，測序深度有限造成真菌序列組裝不起來而影響后續物種注釋；?

2）真菌基因組雜合度高，單個真菌組裝難度就很大，而在宏基因組如此復雜環境中組裝真菌序列難度更大，因此可能在組裝時就只有很少的真菌序列被組裝出來從而影響后續的注釋；?

3）基因預測軟件對原核和真核基因的預測模型不同，而宏基因組基因預測軟件（MetaGeneMark）偏向于原核生物的基因預測，所以在基因預測部分造成預測出來的 真菌基因偏少從而影響后續注釋；?

8.如何查找顯著差異基因的具體序列?

先根據結果文件中挑選出感興趣的KO號，根據KO號在結果文件找到其對應的基因ID號，再根據其基因ID號在文件中尋找其具體的序列信息。?

9.物種注釋others比例高的問題?

對于物種或者功能的注釋結果，基本上是完全復制數據庫中的信息，而這些信息也都是先前研究的結果，因此能夠注釋到的結果，均是選擇了閾值范圍之內得分最高的，結果比較可靠。?

目前我們物種注釋比對使用NR數據庫，涵蓋信息比較全，可能由于樣品本身的特性，這些沒有注釋結果的序列有可能是未知生物，或者是已知生物，但數據庫中信息太少。而我們由于受限于數據庫中的相關信息，因此具體屬于哪一類還不能明確。

10.物種及功能注釋結果中others、Unclassified、Candidatus表示什么？

（1）others表示分類時，程序無法根據規則判斷應該屬于哪一類，可能是注釋到該水平，注釋信息卻是Unclassified，也可能是沒有注釋到該水平；

（2）在種水平上能夠有具體的注釋信息，但是在上層水平上屬Unclassified，這種情況一般表示在比對到的數據庫的某一參考序列有具體的種水平注釋信息，但是在上一層級的分類水平上卻無法區分或所屬上一層級沒有定義好的注釋名稱（Un--s-），這種情況在微生物中較為常見；

（3）Candidatus也是微生物分類學中的一個分類層級，一般是不可培養的微生物，是一 種臨時的分類層級；在二代測序中，即便是接近完整的16S 基因組，也有可能注釋到Candidatus。 ?