文章來源：BMC中國??科研圈?2018-05-11
北京大學生命科學學院 賈璐萌、李亭亭（李程研究組）
真核生物細胞核中的染色質(zhì)通過折疊成高度動態(tài)、復雜的高級結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、復制，以及損傷修復等重要功能。理解染色質(zhì)在細胞核內(nèi)如何折疊，基因組的三維空間結(jié)構(gòu)如何調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、復制和修復等生物學功能，以及探索核染色質(zhì)在遺傳、發(fā)育、分化、癌變等生物學過程中的變化規(guī)律是當前三維基因組學（Three-Dimensional Genomics）研究領(lǐng)域的主要內(nèi)容 (Dekker and Mirny, 2016)。
目前研究染色質(zhì)三維構(gòu)象的主要方法均是在3C（Chromosome Conformation Capture）實驗技術(shù)的基礎上開發(fā)的 (Dekker et al., 2002)。3C實驗技術(shù)最初于2002年由Dekker等提出 (Dekkeret al., 2002)。在3C技術(shù)中，染色質(zhì)構(gòu)象首先被甲醛交聯(lián)固定；隨后，基因組被限制性內(nèi)切酶消化；存在相互作用的染色質(zhì)由于空間接近，在重新連接酶消化后的基因組時，存在相互作用的染色質(zhì)將被連接到一起；解交聯(lián)純化DNA后，針對感興趣的兩個特定基因組區(qū)域分別設計引物，并對重連接產(chǎn)物進行PCR擴增；最后通過PCR條帶的強度，可對這兩個區(qū)域的相互作用情況進行定性或定量評估（圖1）。3C技術(shù)適用于評估兩個目標區(qū)域之間的空間相互作用情況。為了在一次實驗中同時捕獲到更多染色質(zhì)區(qū)域的相互作用，2006年，研究人員在3C技術(shù)的基礎上開發(fā)了適用于捕獲染色質(zhì)某一區(qū)域與全基因組其他區(qū)域間相互作用（一對多）的4C技術(shù) (Simoniset al., 2006; Zhaoet al., 2006)以及同時捕獲染色質(zhì)多個區(qū)域之間相互作用（多對多）的5C技術(shù) (Dostieet al., 2006)。
隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，基于3C實驗技術(shù)、并結(jié)合了高通量測序技術(shù)的Hi-C技術(shù) (Lieberman-Aidenet al., 2009)被開發(fā)（圖2）。在Hi-C技術(shù)中，限制性內(nèi)切酶消化后的染色質(zhì)在末端補平時連入biotin，用于標記重組信號，重組片段通過生物素富集后建庫測序。Hi-C技術(shù)可以同時捕獲全基因組染色質(zhì)間的相互作用。至此，人類首次染色質(zhì)空間相互作用圖譜被繪制：在染色體上，轉(zhuǎn)錄活躍的分區(qū)（compartment A）與不活躍的分區(qū)（compartment B）交錯排列，每個分區(qū)長度從幾Mb到幾十Mb大小不等，其中分區(qū)A富集了基因密度高的區(qū)域和活躍染色質(zhì)修飾標記，而分區(qū) B則多是基因荒漠區(qū)，染色質(zhì)組織結(jié)構(gòu)更緊密 (Lieberman-Aiden et al., 2009)。在每個染色體內(nèi)部還存在更小尺度（平均約800 kb）的拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Topological Associated Domains, TAD）(Dixonet al., 2012; Noraet al., 2012)，TAD內(nèi)部的DNA元件之間形成了較為緊密的相互作用，而不同TAD之間的相互作用則較弱。相鄰TAD的邊界上結(jié)合有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，如CTCF蛋白、cohesin蛋白復合體等，這些蛋白起到組織染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并隔離兩個相鄰的TAD之間互作的功能 (Dixonet al., 2012)。2014年，Aiden等開發(fā)出了用于原位捕獲全基因組水平染色質(zhì)相互作用的in situ Hi-C (Raoet al., 2014)（圖3）。與之前的Hi-C技術(shù)相比，in situ Hi-C 替換消化染色質(zhì)的六堿基識別序列限制性內(nèi)切酶（通常為HindIII）為四堿基識別序列限制性內(nèi)切酶（通常為MboI／DpnII），提高了對染色質(zhì)的切割效率，使更多的染色質(zhì)空間相互作用被捕獲。同時，實驗的酶切-連接反應均在細胞核內(nèi)進行，減少了染色質(zhì)之間的隨機連接。這使得in situ Hi-C技術(shù)不僅能得到更高比例的有效數(shù)據(jù)（reads），同時還提高了染色質(zhì)相互作用矩陣的分辨率。In situ Hi-C不僅可以觀測到A/B compartment，TAD等較大尺度的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過提高測序深度，將染色質(zhì)相互作用矩陣精度提高至1kb，還可以觀測到存在于TAD內(nèi)部的、由CTCF蛋白介導的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（loop）。這些loop調(diào)節(jié)增強子和啟動子間的相互作用，從而調(diào)控基因表達 (Rao et al., 2014)。
盡管in situ Hi-C可以將染色質(zhì)相互作用矩陣的精度提高到1kb，但它需要產(chǎn)生極大的測序量。以人類基因組為例，欲觀測人類細胞核染色質(zhì)間相互作用的loop結(jié)構(gòu)，需要測到TB級的總數(shù)據(jù)量。如此龐大的測序量不僅花費大，而且數(shù)據(jù)處理也更為復雜。因此，Hi-C更適用于研究大尺度上的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，如TAD和A/B compartment，而不適用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間的相互作用。
