UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)登記的DNA聚合酶被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的都有1000多種，想要都介紹恐怕得寫一本書。我選擇了三個(gè)比較有趣的來聊一聊：
它可以不依賴引物，僅在一種叫做末端蛋白的輔助下，起始DNA的復(fù)制。
可以不依賴模板進(jìn)行DNA合成的聚合酶。
能夠在無(wú)引物情況下進(jìn)行DNA合成的聚合酶。
Phi29 DNA Polymerase
Phi29 DNA Polymerase（后面簡(jiǎn)稱Phi29）是從枯草芽孢桿菌phi29噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)的，它屬于聚合酶家族B，具有極其卓越的持續(xù)合成能力和保真性。然而，1984年Blanco等（doi:10.1073/pnas.81.17.5325）就克隆表達(dá)了Phi29，1989年他們（Blanco, 1989）又報(bào)道了Phi29在體外DNA合成上的顯著優(yōu)勢(shì)，它可以合成70Kb以上的DNA鏈。但當(dāng)時(shí)并沒有引起廣泛的關(guān)注，可能是因?yàn)镻hi29耐熱性實(shí)在不好，而Taq DNA聚合酶等耐熱酶又吸引了大批科學(xué)家的注意力，直到近些年來，隨著單細(xì)胞測(cè)序、第三代測(cè)序等新技術(shù)的發(fā)展，Phi29開始聚焦人們的目光。
想要深入了解Phi29的發(fā)現(xiàn)過程，我推薦可以仔細(xì)讀一讀“?29噬菌體的40年（doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093415）”，這是Margarita Salas教授的一篇回憶錄，介紹了她與?29噬菌體的“風(fēng)風(fēng)雨雨”。Margarita Salas教授是西班牙人，最初從事有機(jī)化學(xué)的研究，后來到美國(guó)塞韋羅·奧喬亞（諾貝爾獎(jiǎng)得主，尼倫伯格先生解析遺傳密碼所用的mRNA就是按奧喬亞教授的方法合成的）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士后培訓(xùn)，成為一名優(yōu)秀的生化科學(xué)家。另外，Salas教授的丈夫是Eladio Vinuela，他是SDS-PAGE技術(shù)的發(fā)明者之一。
Phi29蛋白全長(zhǎng)575aa，相對(duì)分子量大約66KD，N端主要負(fù)責(zé)3'-5'外切酶校讀功能和鏈置換功能，C 端結(jié)構(gòu)域行使聚合功能，含有拇指、手掌、手指結(jié)構(gòu)。Phi29的主要特征有：
①Phi29可以在末端蛋白質(zhì)（TP）的輔助下，不依賴引物起始DNA復(fù)制；
②卓越的持續(xù)延伸能力（>70Kb）和優(yōu)秀的保真性（有些商家為了宣傳號(hào)稱Phi保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍，過于夸張了）；
③優(yōu)秀的滾環(huán)復(fù)制活性和多重鏈置換活性；
④Phi29是一個(gè)常溫酶，在30 ℃進(jìn)行反應(yīng)，65 ℃ 放置10 min便可失活。
Phi29最廣泛的應(yīng)用是滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling-circle amplification，RCA）和多重置換擴(kuò)增（Multiple displacement amplification，MDA），下面簡(jiǎn)單介紹一下他們的原理。
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滾環(huán)擴(kuò)增
滾環(huán)，通俗的說就是圍著一個(gè)圓環(huán)轉(zhuǎn)圈圈，以環(huán)狀DNA 為模板，通過短的DNA/RNA引物( 也可以是一個(gè)切口) ，在酶催化下將dNTPs 轉(zhuǎn)變成單鏈DNA。由于Phi29與DNA有很強(qiáng)的結(jié)合作用，而模板又是一個(gè)環(huán)，復(fù)制一圈后延伸并不會(huì)停止，新生鏈不斷把互補(bǔ)鏈置換出去，最后形成的單鏈DNA包含幾十上百個(gè)重復(fù)的模板互補(bǔ)片段，經(jīng)過切割可以得到單位擴(kuò)增子（如圖1 ）。滾環(huán)擴(kuò)增在噬菌體復(fù)制中是很常見的，如果為環(huán)狀單鏈DNA（ΦX174），直接作為模板復(fù)制，如果為環(huán)狀雙鏈DNA，先通過切割酶產(chǎn)生一個(gè)切口，然后起始滾環(huán)復(fù)制。
圖1滾環(huán)復(fù)制圖示 -
多重鏈置換擴(kuò)增
什么叫鏈置換呢？通俗的說，就是以模板鏈合成的新生鏈替代了原來的互補(bǔ)鏈。熱循環(huán)PCR過程中的延伸也是一種鏈置換，不過一般說的鏈置換反應(yīng)都是指等溫?cái)U(kuò)增，因?yàn)闆]有溫度變化也就沒有階段性，退火和延伸始終持續(xù)進(jìn)行。什么叫多重鏈置換呢，就是“同時(shí)多處發(fā)生”，新生鏈的延伸還未完成，被置換的互補(bǔ)鏈又開啟新一輪的置換，引物延伸始終處在“一波還未平息，一波又來侵襲”的狀態(tài)，直至引物消耗完（見圖2）。MDA基于兩個(gè)基本條件：1.具有鏈置換能力的聚合酶，如Phi29，Bst DNA polymerase；2.隨機(jī)引物，常見的是隨機(jī)六引物和9引物。Phi29最常見的MDA是基因組擴(kuò)增，大多采用隨機(jī)引物，復(fù)制起始幾乎無(wú)處不在，所得產(chǎn)物也是有小有大，隨機(jī)分布（見圖3）。
圖2 多重鏈置換擴(kuò)增圖示
可能有人會(huì)有疑問，既然Phi29延伸性能那么好，保真性有高，還能擴(kuò)增高GC%的模板（我曾經(jīng)用隨機(jī)引物擴(kuò)增過GC%大于80%的基因組片段，產(chǎn)量很高），為什么不用于常溫PCR擴(kuò)增大片段呢。如果用特異性引物，就存在兩個(gè)主要問題：1. MDA的優(yōu)勢(shì)是多處起始，特異性引物就失去了這個(gè)優(yōu)勢(shì)，延伸時(shí)只能等新生鏈完成，互補(bǔ)鏈才能起始；2. 低溫退火的特異性太差，會(huì)產(chǎn)生很多干擾產(chǎn)物。如果需要等溫特異性擴(kuò)增，可以考慮Bst DNA Polymerase，它可以在60-65℃ 進(jìn)行RCA和MDA，不過Bst持續(xù)合成能力不如Phi29，也缺乏校正活性。
Phi29是個(gè)很有趣的聚合酶，無(wú)論是其催化性能還是擴(kuò)增方式。對(duì)其進(jìn)行高純度分離純化也是極困難的，它與DNA有強(qiáng)力的結(jié)合作用（當(dāng)Phi29和熱穩(wěn)定DNA聚合酶共存時(shí)，耐熱酶會(huì)引物無(wú)法使用模板PCR失?。?，很難去除與酶結(jié)合的DNA。用于基因組擴(kuò)增、單細(xì)胞測(cè)序的Phi29要求大腸桿菌基因組拷貝<1，我嘗試過PEI核酸沉淀+Ni柱+Heparin柱純化流程，所得產(chǎn)物中仍有大腸桿菌基因組殘留，即使再添加核酸酶預(yù)處理，增加離子柱也沒有徹底解決該問題。有文獻(xiàn)報(bào)道（doi: 10.1371/journal.pone.0082624）使用溴化乙錠競(jìng)爭(zhēng)DNA可以得到無(wú)DNA殘留的純酶，但這種方法操作起來可能有風(fēng)險(xiǎn)，最后我在Ni柱前添加了羥基磷灰石柱吸附與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，才基本解決該問題。
DNA polymerases μ
DNA polymerases μ（后面簡(jiǎn)稱Pol μ）全長(zhǎng)494aa，來源于人類基因組，屬于DNA聚合酶家族X，X家族目前有四個(gè)成員：DNA polymerases β，DNA polymerases λ，DNA polymerases μ和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)。他們都是些性能奇特的聚合酶，想更多了解X家族DNA聚合酶的特征，可以仔細(xì)閱讀Berdis（doi:10.1007/978-3-642-39796-7_5）和Yamtich等（doi:10.1016/j.bbapap.2009.07.008）的報(bào)道。
Domínguez等（doi:10.1093/emboj/19.7.1731）在2000年完成了Pol μ的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)Pol μ同時(shí)具有模板依賴的DNA聚合酶活性和非模板依賴的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，但無(wú)模板聚合活性比有模板存在下的聚合活性第幾個(gè)數(shù)量級(jí)。同年，Aoufouchi等（doi:10.1093/nar/28.18.3684）也報(bào)道了人Pol μ的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果他們沒有檢測(cè)到末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性（后來證明在大腸桿菌中的Pol μ被宿主修飾了，在大腸桿菌中表達(dá)的野生型Pol μ可能沒有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性）。我主要介紹下Domínguez的研究結(jié)果，他們來自于西班牙國(guó)家生物技術(shù)中心，與Phi29研究團(tuán)隊(duì)關(guān)系密切。
①利用RACE技術(shù)得到了Pol μ的cDNA，全長(zhǎng)2589 bp，包括45 bp的5'-UTR，1482 bp的編碼序列和1062 bp的3'-UTR。
②使用pRSET-hPolμ/BL21(DE3) pLysS原核系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，然后用PEI沉淀+硫酸銨沉淀+磷酸纖維素層析+HiTrap肝素層析純化蛋白。
③Pol μ與TdT序列一致性為41%，具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，但活性很低，而且存在摻入偏性：dT >> dC > dG > dA。
④Pol μ在存在DNA模板時(shí)聚合活性顯著增強(qiáng)，但沒有3'-5'的核酸外切或內(nèi)切酶活性，而且延伸錯(cuò)誤率很高。
⑤Pol μ的末端轉(zhuǎn)移活性和依賴DNA的DNA聚合活性均在體外被錳離子強(qiáng)烈激活，而且，在存在Mn2+時(shí)，Pol μ的核苷酸摻入偏性明顯降低。
NrS-1 DNA Polymerase
一般來說，DNA聚合酶都不是“從頭合成”酶，他們總需要一條引物或者至少需要一個(gè)起始用的3'-OH（Phi29也是在TP與dATP形成的復(fù)合物的3'-OH起始）來進(jìn)行DNA合成。在生物體內(nèi)，有一類叫引發(fā)酶（Primase）的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)為DNA合成提供引物，他們與解旋酶、DNA聚合酶共同完成體內(nèi)的DNA復(fù)制。NrS-1 DNA Polymerase（后面簡(jiǎn)稱NrS-1）實(shí)際上一種“引發(fā)酶-聚合酶”雙功能酶，可在沒有任何引物的情況下從特定模板DNA序列啟動(dòng)DNA合成，并且在解旋酶和ssDNA結(jié)合蛋白的幫組下進(jìn)行真正dsDNA擴(kuò)增。
NrS-1不是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的引發(fā)酶-聚合酶，早在2003年就在古細(xì)菌Sulfolobus islandicus的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有ATPase，引發(fā)酶和DNA聚合酶活性的蛋白質(zhì)（doi:10.1093/emboj/cdg246），后來又發(fā)現(xiàn)了來源于人（doi:10.1016/j.molcel.2013.09.025）和Thermus thermophilus（doi:10.1038/ncomms13296）等功能相似的酶。NrS-1與他們都不同，僅與古細(xì)菌質(zhì)粒中的雙功能引發(fā)酶-聚合酶具有弱同源性，但缺少通常存在于引發(fā)酶中的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域。2017年，Zhu B等（doi:10.1073/pnas.1700280114）報(bào)道了NrS-1的克隆表達(dá)程序和酶學(xué)性質(zhì)，主要內(nèi)容包括：
①構(gòu)建pET28b表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)Ni柱和Superdex 200柱分離純化得到純酶。
②NrS-1聚合能力較低，保真性差，NrS-1不依賴引物但需要ssDNA模板。
③NrS-1能夠從dNTP和NTP上起始DNA合成，當(dāng)dNTP和NTP同時(shí)存在時(shí)，NrS-1偏好dNTP。
④NrS-1的最佳反應(yīng)溫度為50°C，產(chǎn)物的長(zhǎng)度從幾百個(gè)核苷酸到約2,000個(gè)核苷酸，聚合反應(yīng)需要Mg2+，最佳濃度在5至10 mM之間。
⑤NrS-1從頭合成效率在不同DNA模板上的巨大差異，完全互補(bǔ)的DNA的兩條鏈的擴(kuò)增效率可能相差若干倍，必須有特定的起始序列，最短為8bp（5'-TTTGACCA-3'）；
⑥NrS-1結(jié)構(gòu)上與古細(xì)菌引發(fā)酶具有弱同源性，N端截短結(jié)構(gòu)仍有從頭合成能力，但活性低于全酶，N端負(fù)責(zé)聚合，C端負(fù)責(zé)DNA結(jié)合；
⑦NrS-1在解旋酶或ssDNA結(jié)合蛋白的協(xié)調(diào)下，能夠增強(qiáng)延伸能力，但隨著NrS-1濃度增加延伸長(zhǎng)度逐漸減小。
NrS-1的發(fā)現(xiàn)改變了人們對(duì)DNA聚合酶不能從頭合成DNA的教條性認(rèn)識(shí)，不但有趣而且意義重大，Guo H等（doi:10.1016/j.bbrc.2019.01.144）解析了NrS-1的晶體結(jié)構(gòu)，有興趣的可以仔細(xì)了解下。
結(jié)語(yǔ)
在傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)中，進(jìn)行DNA合成時(shí)必須要有DNA模板和引物，而本文介紹的聚合酶（Phi29 DNA Polymerase不需要寡核苷酸引物，但需要DNA模板，且需要末端蛋白的輔助；DNA Polymerases μ可以不需要模板，但需要引物，且存在模板是聚合能力顯著增強(qiáng)；NrS-1 DNA Polymerase不需要引物，但需要模板。）拓寬了人們對(duì)DNA復(fù)制方式的認(rèn)識(shí)。
