劉小澤寫于18.9.9
今天了解一下背景知識，為下面進行芯片數據分析打下基礎
應用領域之基因芯片
Bioconductor的起源就是基因芯片分析，因此提供了芯片數據庫如GEO、ArrayExpress結口，方便獲取數據
芯片提供商：Affymetrix、Illumina、Nimblegen、Agilent
- Affemetrix 3‘-biased Arrays芯片數據需要affy、gcrma、affyPLM包，這三個包又依賴于芯片定義（CDF）、探針（Probe）、注釋（Annotation）三個包，后三個會隨前三個安裝而自動裝好；另外還需要手動安裝ROOT包，這個包可以直接使用Affymetrix的數據文件，支持的格式有CDF、PGF、CLF、CSV
- Affymetrix Exon ST Arrays與Affymetrix Gene ST Arrays芯片需要oligo包和xps包。Ologo包又需要調用pdInfoBuilder包來創建一個pdInfoPackage包，pdInfoPackage包的作用就是合并CDF、Probe、Annotation三種數據
- Affymetrix SNP Arrays、Affymetrix Tilling Arrays、Nimblegen Arrays芯片數據處理只需要oligo包
- Ilumina Expression Microarrays芯片數據需要lumi和beadarray包，這兩個包都有各自的映射包和注釋包：lumi需要lumiHumanAll.db、lumiHumanIDMapping包；beadarray需要illuminaHumanv1BeadID.db、illuminaHumanv1.db包
芯片類型：基因表達芯片、外顯子芯片、拷貝數變異檢測芯片、SNP芯片、DNA甲基化芯片等
芯片分析內容：預處理、質量評估、差異基因表達分析、基因集富集分析、遺傳基因組學
應用領域之測序數據
R也可以處理多種類型數據：fasta、fastq、SAM、BAM、Gff、Bed、Wig等，可以進行測序結果預處理（去除低質量、序列污染等）、格式轉換、序列比對、測序質量評估、RNA-seq、差異表達分析、ChIP-seq等
- SRAdb包是SRA數據庫的接口
- ShortRead包讀入測序數據，進行質控、預處理；Rsamtools將數據比對到參考基因組/轉錄組，完成格式轉變和比對結果統計；rtracklayer包將數據導入USCS基因組瀏覽器(http://genome-asia.ucsc.edu/)進行瀏覽、操作、輸出
- IRanges、GenomicRanges、genomeIntervals包是基于DNA區域（如染色體）進行數據操作的拓展包；Biostrings包含了序列比對、模式匹配等基本序列分析函數；BSgenome針對有注釋的全基因組數據進行操作；GenomicFeatures是對基因組中序列特征（如非編碼區）進行注釋
- RNA-seq可用的包有：limma（金標準）、edgeR、DESeq、DEXSeq（外顯子水平）、baySeq
- ChIP-seq：基序發現(Motif discovery)、結合位點檢測（Peak calling），可以用CSAR、chipseq、ChIPseqR、ChIPsim、ChIPpeakAnno、DiffBind、iSeq、rGADEM、segmentSeq、BayesPeak、PICS
更多的數據處理，可以看https://www.bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html=》softeware=〉technology
應用領域之注釋
注釋既需要注釋工具，有需要鏈接注釋數據庫的接口，大體的注釋方式有三類
第一類：基于AnnotationDbi包的擴展包
絕大部分注釋包都依賴AnnotationDbi包，一旦biocLite安裝任何一個“.db”的注釋包，AnnotationDbi包都會自動安裝。這個包可以創建、操作“.db”，并且可以創建個性化的芯片平臺。它又可以分為三類注釋包
- 物種型注釋包：org.Mm.eg.db、org.Hs.eg.db、org.Rn.eg.db等
包括整個物種相關的基因數據，命名格式："org.Xx.yy.db"， Xx是種屬的縮寫（注意首字母大寫），“yy“來源數據庫ID，這個ID用于把所有數據連在一起。如：“org.Hs.eg.db”中Hs是種屬，eg是數據庫ID - 平臺型注釋包：如Affymetrix公司的hgu133plus2.db
依賴于具體的實驗平臺，命名格式：“platformName.db”。“platform”是芯片平臺名稱，如“hgu95av2.db”就是利用了Affymetrix公司的hgu95av2基因芯片；另外每個“.db”包還需要對應的“.cdf”、“.probe”，名稱分別為：“platformName.cdf”、“platformName.probe” - 系統生物學注釋包：用于下游分析，如基因功能分析（與上游），比如KEGG.db用來獲取KEGG數據庫的數據；GO.db用來獲取GO數據庫的數據；PFAM.db用來獲取不同蛋白家族的特征和相關性
第二類：基于biomaRt包獲取注釋
它與AnnotationDbi包雖然注釋信息都是來自遠程數據庫，但是AnnotationDbi是將注釋包本地化，而biomaRt只提供了一組數據接口，加載注釋內容嚴重依賴網絡，并且無需維護，不占用本地存儲，注釋信息自動更新。但它的功能最為強大，因為可以連接各個主要的是給你想你數據庫來獲取注釋信息和數據
應用領域之高通量實驗
包括流式細胞儀（Flow Cytometry）、定量PCR、質譜（Mass soectrometry）、蛋白質組及其他基于細胞水平的高通量實驗數據
定量PCR：HTqPCR、ddCt、qpcrNorm提供如何分析循環閾值（Cycle threshold）的方法
利用Bioconductor分析芯片數據
芯片分析主要就是利用bioconductor，分析的過程也體現了它的設計理念和編程思想
基因芯片背景知識
以Affymetrix為例，一個芯片可以包括上百萬探針（通常由25個堿基組成），被整齊印刷在芯片上。
探針組：一個探針組通常由20對個或11個探針對組成，來自一個基因
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探針對：匹配探針（Perfect match， PM）+錯配探針（Mismatch， MM）。二者僅僅是中間的那個堿基不同。并非所有芯片都有這兩個探針，比如外顯子芯片，每個探針組只有4個PM探針，沒有MM探針
探針與探針對
探針序列來源：公共核酸數據庫中的參考序列（如NCBI的GenBank或RefSeq）
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不同的芯片中，探針組在參考序列中的分布不同，也就是檢測范圍不同。3‘表達譜芯片探針組排列在參考序列3’末端附近的一至兩個外顯子上；外顯子芯片中，每個長度大于25個堿基的外顯子都有對應的探針組；鋪瓦芯片（Tilling array）中，探針基本覆蓋了所有的外顯子和內含子
探針組與基因
探針組與基因關系：芯片數據得到的表達矩陣，實際上是以探針組為單位，而不是直接以基因為單位，每一行對應一個探針組的表達量。后期的分析都是先得到探針組的結果，然后根據注釋的ID映射才對應到基因。一般是一個基因同時對應多個探針組。通常會把同一個基因對應的探針組表達量求均值，然后找最大的那個探針組作為代表，讓它與該基因一一對應
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芯片數據獲取：一是掃描設備對芯片進行掃描，得到熒光信號圖像文件（DAT文件）；二是由系統自帶的圖像處理軟件，經過網格定位（Griding）、雜交點范圍確定（Spot identifying）、背景噪音過濾（Noise filtering），從芯片圖像中提取數據，得到CEL文件
芯片產生的數據文件
關于Affymetrix的數據處理過程：https://slideplayer.com/slide/4804237/
- CEL文件：CEL文件是Affymetrix最常用的格式，它的主要內容就是每個“cell”的灰度信息，而“cell”就是整個芯片圖像劃分后得到的小網格，每個小網格中的圖像被看作來自一個探針。【補充】當然，如果要得到芯片上每個探針組對應的表達數據，還需要探針的排布信息（哪個探針對應哪個探針組），這部分信息就存儲在CDF文件中。要想知道探針對應的序列信息，就需要用Probe文件
完成一個小任務
從CLL數據包載入芯片數據=》預處理（先進行一個背景校正）=〉獲得探針組表達矩陣
先說一下這個CLL數據集，它包含的是慢性淋巴細胞白血病（Chromic lymphocytic leukemia, CLL）的數據，采用Affymetrix的hgu95av2表達譜芯片（含有12625個探針組），共24個樣品（"CLL1.CEL"-"CLL24.CEL"），每個樣品來自不同的癌癥病人。
根據健康狀態分為兩組（對照試驗）：穩定組（stable）和惡化組（progressive），每組各12個（平行試驗）。
得到的e矩陣是一個12625行、24列的探針組表達矩陣
#安裝并加載
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
options(BioC_mirror="http://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/")
biocLite("CLL")
library(CLL)
#讀入示例數據
data("CLLbatch")
# rma方法進行背景校正【當MM值比PM值還要高時，MM就是雜信號，也就是背景噪聲，需要去除】
CLLrma <- rma(CLLbatch)
e_before <- exprs(CLLbatch)
e_after <- exprs(CLLrma)
#對比一下校正前后數據
e_before[1:5,1:5]
e_after[1:5,1:5]
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