Comprehensive analysis of the immunological implication and prognostic value of CXCR4 in non-small cell lung cancer
CXCR4在非小細胞肺癌中的免疫學意義和預后價值的綜合分析
發表期刊：CANCER IMMUNOL IMMUN
發表日期：2022 Oct 29
影響因子：6.630
DOI:? 10.1007/s00262-022-03298-y
一、研究背景
????????肺癌的死亡率最高，發病率在各種癌癥中排名第二，約占癌癥相關死亡總數的18%。它是一種高度惡性的腫瘤。根據組織病理學類型，約85%的肺癌被歸為非小細胞肺癌（NSCLC），其中肺腺癌（LUAD）和肺鱗癌（LUSC）是最常見的亞型。
????????目前有48種趨化因子，屬于四個亞家族；它們與七種跨膜的G蛋白偶聯受體（GPCRs）相互作用，在體內不同條件下影響免疫細胞的運輸。近年來，許多研究表明，趨化因子/趨化因子受體環路以自分泌和旁分泌形式相互作用，促進腫瘤細胞生存和生長，加速腫瘤新血管生成。
二、材料與方法
1、數據來源
1） 實驗部分涉及中國醫學科學院國家癌癥中心/癌癥醫院（NCC/CAMS，中國北京）的NSCLC患者的回顧性研究，包括242名LUAD患者和188名LUSC患者（隊列1）
2） 13名LUAD患者和33名LUSC患者（隊列2）
3） CXCR4 mRNA表達譜數據和突變注釋數據從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫下載
4） LUAD樣本數據集（535個癌癥組織和59個正常組織）和LUSC樣本數據表達譜（502個癌癥組織和49個正常組織）均從TCGA獲得
5） 從癌癥細胞系百科全書（CCLE）數據庫中提取了188個肺癌細胞系的RNA-seq數據
2、分析流程
1） NSCLC中的腫瘤浸潤性免疫細胞景觀及其與CXCR4的相關性：CIBERSORT、TIMER
2） 評估CXCR4表達對預測免疫治療反應的作用：從TCGA數據庫中獲得了經典免疫檢查點的表達數據，分析了CXCR4表達與這些標志物之間的差異和關聯性；加入被廣泛認可的免疫反應標志物，腫瘤突變負擔（TMB）、免疫分數（IPS）、新抗原和腫瘤免疫功能紊亂和排斥（TIDE）分數，以進一步評估CXCR4潛在的免疫治療反應預測性能
3） 基因組富集分析：GSEA
4） 免疫調節劑的確定及其與CXCR4的關系從TISIDB中確定了與CXCR4顯著相關的免疫刺激劑和免疫抑制劑，將這些免疫調節劑輸入STRING數據庫，以生成一個蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡，并探討它們在NSCLC中的意義；進行了GO注釋和KEGG途徑富集分析
5） CXCR4相關免疫調節劑簽名和nomogram的構建：識別出與LUAD和LUSC表現出明顯相關性的免疫刺激因子和免疫抑制劑，并采用Cox模型中的Akaike信息準則對變量進行依次篩選；對年齡和TNM分期進行了單變量和多變量Cox回歸分析，以確定NSCLC患者的獨立預后因素；構建一個nomogram，為每個NSCLC患者的疾病進展提供一個預測模型
6） 免疫組化（IHC）染色和CXCR4表達的評估、RNA制備和RT-PCR
三、實驗結果
01 - CXCR4與免疫細胞浸潤之間的相關性
????????利用CIBERSORT程序計算TCGA數據庫中LUAD和LUSC患者的基因表達譜得到22種免疫細胞的浸潤率。LUAD和LUSC患者組織中的幼稚B細胞、漿細胞、T濾泡輔助細胞、T調節細胞、γδT細胞、M1巨噬細胞、靜止樹突狀細胞（DC）和嗜酸性粒細胞的浸潤水平明顯高于正常組織。腫瘤組織中靜止的CD4記憶T細胞、活化的CD4記憶T細胞、單核細胞、M2巨噬細胞、靜止的肥大細胞和中性粒細胞的浸潤水平都明顯高于正常組織。記憶B細胞在LUAD組織中尤其明顯富集，而M0巨噬細胞和活化的DC在LUSC患者中明顯富集。靜止的自然殺傷（NK）細胞的浸潤水平在LUAD和LUSC中是對比鮮明的（圖1A，B）。22種免疫細胞在LUAD和LUSC腫瘤和正常組織中的不同浸潤水平以熱圖的形式顯示出來（圖1C，D）。此外，相關熱圖顯示，22種免疫細胞在LUAD和LUSC腫瘤中表現出弱到中等程度的相關性（圖1E，F）。
????????為了探索CXCR4表達協調LUAD和LUSC變化的潛在機制，確定了與CXCR4相關的突變基因。根據CXCR4表達的中位數將LUAD患者（補充圖2A，C）和LUSC患者（補充圖2B，D）分為高表達組和低表達組后，構建了一個熱圖來確定與CXCR4表達相關的突變基因的突變頻率。隨后，發現DNAH8、PAPPA2、SPHKAP、XIRP2和ZNF804B（補充圖2E）的突變頻率在LUAD隊列的CXCR4高表達組和低表達組中存在明顯差異。同樣，CSMD2、PCDH15、RELN、SI和ZNF804A的突變頻率在LUSC隊列的CXCR4高表達和低表達組中也有明顯不同（補充圖2F）。
????????為了闡明CXCR4調節不同免疫細胞浸潤的內在機制，作者首先調查了主要免疫細胞與CXCR4表達之間的相關性。發現在LUAD中，CXCR4與腫瘤純度呈中度負相關，而與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和DC細胞的腫瘤浸潤呈中度正相關（補充圖3A）。在LUSC中，CXCR4的表達與主要免疫細胞之間的相關性與LUAD中觀察到的相似，但更為顯著，特別是CXCR4與DC細胞之間的相關系數為0.624（補充圖3B）。接下來，分析了CXCR4中的體細胞CNAs對免疫細胞浸潤的影響。在LUAD中，CXCR4中的CNAs，包括臂級缺失和臂級增益，顯著影響B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和DCs的浸潤水平（補充圖3c）。在LUSC中，臂級增益和高擴增顯著影響B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和DCs的浸潤水平（補充圖3D）。此外，還評估了LUAD和LUSC中CXCR4表達和22種免疫細胞之間的相關性。
02 - CXCR4在預測NSCLC患者免疫治療反應中的潛在價值
????????為了探索CXCR4預測NSCLC患者免疫治療反應的可能性，將PD1（PDCD1）、PDL1（CD274）、CTLA4、LAG3、GAL9（LGALS9）、TIM-3（HAVCR2）、TIGIT和PD-1LG2（PDCD1LG2）作為免疫檢查點相關候選基因，評估其與CXCR4的關系。結果顯示，CXCR4與LUAD中這些經典的免疫檢查點的表達明顯正相關，PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT和PD-1LG2的相關系數均大于0.5。此外，上述免疫檢查點在CXCR4高表達組明顯上調。在LUSC中，CXCR4和免疫檢查點之間的差異和相關關系呈現出與LUAD相同的趨勢。
????????近年來新開發的、被廣泛認可的免疫反應標志物，包括TMB、IPS、neoantigen、TIDE評分、T細胞功能障礙評分和T細胞排斥評分也被用于綜合評價。在LUAD中，沒有發現高低CXCR4表達組的TMB、IPS和neoantigen水平有明顯差異，但CXCR4高表達組的TIDE評分明顯較低，T細胞功能障礙評分較高，T細胞排除評分較低，說明CXCR4高表達組可能對免疫治療更敏感（補充圖7A）。在LUSC中，CXCR4高表達組的TMB、IPS和T細胞功能障礙評分明顯增加，而TIDE評分和T細胞排異評分明顯下降，也顯示了CXCR4在預測免疫治療反應方面的潛力（補充圖7B）。
????????接下來，對患者（隊列2）進行RT-PCR分析，以驗證CXCR4表達與免疫治療反應之間的相關性。在LUAD患者中，CXCR4的高表達與更好的免疫治療反應基本一致。四名PR的患者中，有三人的CXCR4表達高于SD的患者（圖2A，B）。百分比直方圖還顯示，在LUAD中，CXCR4高表達組的反應率高于低表達組，但由于樣本量的限制，沒有得到明顯的P值（圖2C）。在LUSC患者中，PR和CR患者顯示出CXCR4的高表達（圖2E，F）。百分比直方圖顯示，在LUSC中，CXCR4高表達組的反應率高于低表達組（圖2G）。ROC曲線顯示，CXCR4表達在LUAD免疫治療反應隊列中的AUC值為0.7778，在LUSC免疫治療反應隊列中的AUC值為0.7231，表明CXCR4表達水平具有預測免疫療效的良好潛力（圖2D，H）。此外，對隊列2樣本進行IHC染色，以探索CXCR4表達與免疫治療反應的相關性。在最后的26個IHC染色樣本中，分別在LUAD、LUSC和總體三組進行分析，發現CXCR4高表達組和低表達組之間的免疫治療反應沒有達到統計學意義（補充圖8A-C）。然而，在26名NSCLC患者中，38%的樣本在RNA和蛋白水平上有一致的CXCR4表達，這需要通過擴大樣本進一步驗證（補充圖8D）。
03 - CXCR4相關的生物過程和途徑
????????通過GSEA確定與LUAD和LUSC中CXCR4上調相關的信號通路。MYC靶點、異體移植排斥反應、DNA修復和炎癥反應是LUAD中富集的前四個通路（補充圖10A）。Notch信號、TGF-beta信號、頂端連接和上皮-間質轉化是LUSC富集的前四個途徑（補充圖10B）。CCLE數據庫中118個肺癌細胞系的RNA-seq數據顯示，糖胺聚糖降解、長期抑制、磷脂酰肌醇信號系統和半乳糖代謝是肺癌細胞中最豐富的信號通路（補充圖10C-F）。
04 - CXCR4在NSCLC中表達的預后潛力
????????為了闡明CXCR4表達在LUAD和LUSC中的預后價值，對NCC隊列的獨立樣本進行了IHC染色和生存分析，發現CXCR4的高表達與LUAD（圖3A）以及LUSC患者（圖3B）的預后不良明顯相關。用CXCR4抗體對LUAD和LUSC腫瘤組織進行IHC染色，分別見圖3C和D。
????????進一步，LUAD患者的單變量分析顯示，OS與年齡、腫瘤長度、分化程度、T期、淋巴結轉移、TNM分期和CXCR4表達顯著相關。多變量分析顯示，年齡、腫瘤長度、分化、淋巴結轉移和CXCR4表達是LUAD的獨立預后因素。在LUSC患者中，OS與腫瘤長度、分化程度、T分期、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，T分化程度、T分期和TNM分期被確定為LUSC的獨立預后因素。
05 - 構建基于CXCR4相關免疫調節劑的預后特征
????????為了進一步闡明CXCR4的免疫特性，作者鑒定了19種免疫刺激因子和11個免疫抑制劑與LUAD以及LUSC中的CXCR4顯著相關（圖4A, B）。隨后，在STRING數據庫中構建了一個包含30個明顯相關的免疫調節劑的PPI網絡，包含30個節點和262條邊（圖4C）。GO富集分析顯示，這30種免疫調節劑所涉及的生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）涵蓋了淋巴細胞活化、白細胞細胞間粘附、質膜外側、腫瘤壞死因子受體結合等調節。KEGG分析顯示了免疫調節劑參與的頂級信號途徑，包括腸道免疫網絡的IgA產生、細胞因子-細胞因子受體的相互作用和細胞粘附分子（圖4D）。
????????為了探索CXCR4的預后價值，在LUAD和LUSC中構建了基于CXCR4相關免疫調節劑的預后特征。在LUAD中，對確定的免疫調節因子進行了單變量和多變量的Cox回歸分析，發現HAVCR2、TGFBR1、CD40LG、CD70、CD80、KLRK1、MICB和TNFRSF17與LUAD患者的OS顯著相關。隨后，調整了截止值，構建了一個預后特征。根據最低標準和每種免疫調節劑的風險得分，產生了一個包含12種免疫調節劑（HAVCR2、TGFBR1、CD40、CD40LG、CD70、CD80、CXCR4、ENTPD1、KLRK1、MICB、TNFRSF14和TNFRSF17）的簽名（圖5A）。LUAD風險評分計算如下：
????????風險評分=（0.5448 * HAVCR）+（2.0341 * TGFBR1）+（0.7648 * CD40）+（0.3699 * CD40LG）+（2.9431 * CD70）+（0.6282 * CD80）+（0.6749 * CXCR4）+（0.7319 * ENTPD1）+（0.6553 * KLRK1）+（3.0730 * MICB）+（0.5057 * TNFRSF14）+（0.7327 * TNFRSF17表）。根據風險評分中值將患者分為高危組和低危組。生存分析顯示，高危組的OS明顯短于低危組（圖5C）。高危組和低危組的風險評分和基于TNM分期的曲線下面積（AUC）分別為0.786和0.683，結合風險評分和TNM分期計算的AUC為0.816，表明該特征的預測性能良好（圖5E）。同樣，在LUSC中，根據CXCR4相關的免疫刺激物和免疫抑制劑構建了16種免疫調節物（ADORA2A、BTLA、CTLA4、IDO1、TGFBR1、C10orf54、CD70、HHLA2、ICOSLG、IL6、IL6R、KLRC1、KLRK1、PVR、TNFRSF13C和TNFRSF18）的預后簽名（圖5B）。高風險分值與LUSC患者的不良預后明顯相關（圖5D）。風險評分的ROC-AUC為0.809，通過結合風險評分和TNM分期計算的AUC為0.817（圖5F）。
?????????圖6A和B通過點狀分布圖和熱圖顯示每個LUAD和LUSC患者的風險評分、OS和生存狀態。單變量Cox回歸模型顯示，TNM病理分期、風險評分與LUAD和LUSC的OS顯著相關，多變量Cox回歸分析證實風險評分是LUAD的獨立預后因素（圖6C，D）。最后，根據LUAD和LUSC患者的風險評分構建了一個預后nomogram，它可以通過不同的變量計算出3年和5年的生存概率。
四、結論
????????綜上所述，本研究初步顯示了免疫TME在NSCLC患者中的重要性，并確定了CXCR4與NSCLC免疫細胞浸潤之間的相關性。作者在兩個NSCLC獨立隊列中證明了CXCR4在預測免疫治療反應方面強大而可靠的預后價值和性能。更重要的是，所構建的CXCR4相關免疫調節劑的預后特征被證明能準確預測LUAD和LUSC患者的生存狀態，并應在臨床中實施。
