1 、天魁星 呼保義 宋江
Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment
基于單細胞測序的肺癌腫瘤免疫微環境中基質細胞的圖譜
背景
癌旁的基質細胞，如巨噬細胞，T細胞和纖維母細胞，組成了腫瘤的微環境。腫瘤微環境是一個極其復雜的細胞生態系統，但是這些基質細胞的異質性，以及基質和腫瘤細胞之間的相互影響都還沒有明確的研究成果。
本文揭示肺癌微環境的構成，從基質細胞（stromal cell）亞群、信號通路、關鍵分子以及肺癌患者生存分析四個層面開展研究。
首先作者選擇了未經治療的肺鱗癌 (LUSC) 或肺腺癌 (LUAD) 患者5 例從每個患者同一肺葉的遠端區域采集一份正常肺組織樣本，并采集三份腫瘤組織樣本，快速消化成單細胞懸浮液，進行單細胞測序
結果是從 52698 個細胞中獲得了約2000萬個轉錄本，其中，39,323 個細胞 (75%) 來源于肺腫瘤，13,375 個細胞來自正常組織，在校正之后后，作者根據2192 個基因進行主成分分析，進而將細胞分成了8種不同的亞群：癌細胞、免疫細胞（骨髓細胞、T細胞和B細胞）、纖維母細胞、內皮細胞、肺泡細胞和上皮細胞。不同亞群之間，轉錄本數目存在顯著差別，每個T cell有1,678 trans (764 genes)，每個cancer cell有6,746 trans (1,828genes)本圖中展示的是t-sne后結果，從左到右分別按照來源、病人、細胞分型和轉錄本數目進行染色
接下來，作者分析每種細胞亞型的標記基因，并在t-sne結果圖中染色，突變上方每列是細胞亞型，左下角對應標記基因區分細胞類型的標記基因。endothelial cells：CLDN18, FOLR1, AQP4 and PEBP4endothilial：CLDN5, FLT1, CDH5 ，RAMP2epithelial cells: CAPS, TMEM190, PIFO，SNTNfibroblasts,COL1A1, Decorin (DCN) Collagen type I alpha 2 (COL1A2) and C1R 9 ; B-cells,：genes encoding the B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha (CD79A),Immunoglobulin Kappa Constant (IGKC), Immunoglobulin Lambda Constant 3 (IGLC3) and Immunoglobulin Heavy Constant Gamma 3 (IGHG3)myeloid cells, genes encoding Lysozyme (LYZ), the Macrophage Receptor With Collagenous Structure (MARCO), CD68 and CD16a, the Fc Fragment Of IgG Receptor IIIa (FCGR3A) 10T-cells：genes encoding CD3D and the T-Cell Receptor Alpha Constant, and Beta Constants 1 and 2. (TRAC, TRBC1 and TRBC2).
由于在單細胞樣本制備過程中，可能刺激細胞產生應激導致轉錄本發生改變，作者接下來分析細胞與應激相關的基因表達。直方圖顯示了 52698 個細胞中分離相關基因表達的分數，橫軸代表應激相關基因轉錄本在細胞轉錄本中的百分比，縱軸代表細胞數量紅色虛線代表作者設定的閾值，結果僅有少數細胞 (1.96%) 應激相關基因，劃分為應激基因表達陽性。因此，組織分離對細胞的刺激不是影響細胞分型的主要因素。此外作者還考慮到單細胞樣本制備時不同組織接力成單細胞的難易程度對細胞分類的影響，所以接下來選取了另一名患者的腫瘤和正常樣本進行bulk RNA-seq，發現與單細胞測序數據進行比較，結果有很好的相關性，r = 0.71。
下圖中展示的是不同細胞類型的百分比，綠色代表對細胞群測序的對應的百分比和藍色代表對單細胞測序的結果。內皮細胞和肺泡細胞不論是真常組織還是癌癥組織，對應的百分比都偏低。反之亦然，根據 bulk RNA-seq 分析，免疫細胞類型比bulk mRNA-seq更高組織解聚后不同類型細胞解離效率存在差異，與免疫細胞相比，成纖維細胞和內皮細胞與細胞外基質和基底膜結合牢固，因此解離更困難。
為了鑒定這 8 種主要細胞類型中的亞類，對每種細胞類型進行了主成分分析，進而將不同的基質細胞分為52個亞群和癌細胞分為12 個亞群。從左到右，依次是來源百分比，病人來源，細胞數目，轉錄本數目。從第二張圖中可以看到，癌細胞亞群具有高度患者特異性。相比之下，基質細胞亞包涵體主要由 3 個或更多患者的細胞組成。
為了驗證分類結果，作者來自另外 3 例 NSCLC 患者的另外 40250 個單細胞的樣本進行驗證，取樣過程與之前相同，同一肺葉3分腫瘤樣本和1分正常肺組織，進行單細胞測序，基質細胞可以被匹配到之前到52 個基質細胞亞集群中的 45 個， 45 種亞型 占 52 種細胞亞型中， (87%) 的細胞。另外有 7 種細胞亞型，由于檢出細胞小于10個，被舍棄。在完成對基質細胞分型后，接下來作者就每類細胞分別從分型、標記基因、差異表達通路等方面進行詳細的分析。首先是：
對得到的 1592 個內皮細胞進行重新聚類分為 6 個簇Cluster 1：正常組織來源，MT2A +Cluster2 ：未發現標記基因，在進一步分析時丟棄。Cluster3 ：血液內皮細胞，IGFBP3 +，主要來自腫瘤樣本Cluster4：血液內皮細胞，SPRY1 +，腫瘤樣本Cluster5：血液內皮細胞， EDNRB +Cluster6：淋巴管內皮細胞，PDPN 和 PROX1
緊接著作者，對選擇的標記基因進行驗證，從TCGA的選擇正常組織、肺鱗癌和肺腺癌樣本，分析標記基因的表達，正常和腫瘤內皮細胞的marker gene分別在非惡性肺和肺腫瘤中富集
對內皮細胞轉錄本表達豐度進行研究，發現腫瘤來源的內皮細胞轉錄本比正常組織來源的轉錄本高2-4倍
對腫瘤和正常內皮細胞的差異表達基因通路分析，腫瘤來源的內皮細胞Myc原癌基因（原癌細胞）在腫瘤來源的內皮細胞活性高，提示腫瘤來源的內皮細胞中轉錄速度加快，使得轉錄本數目增多
此外炎癥反應相關的通路在腫瘤來源的內皮細胞中下調
進一步分析相關的免疫基因表達，作者基因下調與免疫激活和免疫細胞歸巢相關基因下調：HLA-DQA1、HLA-DQB1：主要組織相容性復合體，負責呈遞抗原表位CCL2：免疫細胞趨化ICAM1：免疫細胞歸巢而血管生成相關的基因表達上調，以上結果表明腫瘤內皮細胞收到腫瘤微環境的影響，下調其抗原呈遞和免疫細胞歸巢活性，從而有助于腫瘤的免疫耐受。
SCENIC分析轉錄因子活性，篩選出得到的10個最顯著差異的轉錄因子而 Fos/Jun 和 ELF3 的下調以及 FLI1 和 TEAD1 的上調是腫瘤特異性內皮細胞表型的原因
接下來作者分析成纖維細胞
1465個纖維母細胞分成7個cluster
Cluster 1、2、4、5、7在腫瘤中富集
cluster 6：在正常組織中富集，彈性蛋白表達水平較高，而一些膠原蛋白（I, III, V 和VIII）表達水平較低
cluster 3 主要由質量較低的細胞組成，在進一步分析時將其丟棄
緊接著作者，對選擇的標記基因進行驗證，從TCGA的選擇正常組織、肺鱗癌和肺腺癌樣本，分析標記基因的表達
由于成纖維細胞通過分泌膠原蛋白影響細胞外基質的成分，作者分析不同亞群較遠蛋白基因表達并通過cluster 1 ：COL1A1cluster 2：expressing COL4A1cluster 6：COL6A2
每個成纖維細胞cluster之間轉錄因子表達的比較。
MEF2 C 和 ELK3 調控的基因在細胞簇 2 中高度上調，而 FOXO1 和 MSC 調控的基因下調在簇 1 中，HOXB2 和 FOXO1 調控的基因是高度上調的。
tSNE 圖，HOXB2 和 MEF2C 的顏色編碼表達（分別在頂部和底部），這些轉錄因子調節子活性的 AUC 估計值（中間）和 GSVA 指示通路的估計值（右）。
不同來源的成纖維小轉錄因子獲悉不同，導致條共計因 活性不同，影響膠原蛋白合成，表明每種纖維原細胞都有功能特異性。
B細胞和巨噬細胞在腫瘤中分布
5603個B細胞分成9個cluster，6個在腫瘤中富集，3個在正常組織中富集（cluster 4、8、9）。濾泡 B 細胞：高水平表達 CD20 (MS4A1)、CXCR4 和 HLA-DRs，富集于cluster1 和cluster2Plasma B：表達免疫球蛋白 γ富集于cluster 3 and 6粘膜相關淋巴組織來源 (MALT) B 細胞：富集于cluster 5 and 7作者對來自TCGA的腫瘤樣本和正常組織樣本標記基因表達
接下來，與之前類似，作者進行腫瘤來源于正常組織來源細胞差異表達基因通路分析pathway分析未找到正常組織和腫瘤來源的plasma B細胞或MALT B細胞之間的差異。但作者鑒定出了腫瘤相關的follicular B細胞的氧化磷酸化、細胞增殖相關通路下調；腫瘤相關的follicular B細胞的轉錄本比正常的低37.9%，提示follicular B在腫瘤中處于耗竭狀態
9756個髓樣細胞分成12個cluster，粒細胞對應（簇 7；S100A12 +），三個簇對應于樹突狀細胞：朗格漢斯細胞（cluster 5；CD207 +），單核細胞來源的樹突狀細胞（cluster；FCGR3A +，CYTIP +）和交叉遞呈樹突狀細胞（簇 12；CLEC9A + 和 XCR1 +）
cluster 1、2 和 3 未能確定特異性表達的基因
作者對來自TCGA的腫瘤樣本和正常組織樣本標記基因表達進行驗證
腫瘤源性巨噬細胞的炎癥反應，TNF-α 誘導的增殖和活性氧產生通路的強烈減少。
SCENIC 發現，受 IRF2、IRF7、IRF9 和 STAT2 轉錄因子調控的基因在一部分腫瘤相關巨噬細胞中上調，而 Fos/Jun 和 IRF8 調控基因表達下降。值得注意的是，IRF2 在巨噬細胞中具有免疫抑制作用，而 Fos/Jun 可以增強巨噬細胞的炎癥反應，
巨噬細胞按照其表型和分泌的細胞因子可以分為兩種極化類型,即經典活化（Classically activated）的M1型和選擇性活化（Alternatively activated）的M2型巨噬細胞。巨噬細胞的極化分型在腫瘤、脂肪等多數組織中廣泛存在,并對某些腫瘤的預后有指導意義
這些數據支持人類腫瘤中腫瘤巨噬細胞的 M2 極化，并確定 NSCLC 中這些變化背后的引人注目的候選轉錄因子。
腫瘤T細胞轉錄組揭示了新的免疫治療靶點
檢測到 24911 個細胞，T 細胞發現了 9 個簇，分別被指定為調節性 T 細胞（FOXP3 +，簇 7），自然殺傷和自然殺傷 T 細胞（FGFBP2 +，簇 6），CD8 + T 細胞（CD8A +；2，4，5 和 8）和 CD4 + T 細胞（CD4 +；1，3 和 9）
比較了腫瘤和非惡性肺 T 細胞的通路表達水平。不同 T 細胞表達大致相同例如
糖酵解上調和減少氧化磷酸化。此外，除了腫瘤特異性、增殖性
CD8 + T 細胞簇 8 以外，腫瘤源性 T 細胞的細胞增殖途徑普遍較低。
T 細胞亞型之間的一些通路存在差異調節。對于 CD8 + T 細胞IFN-γ 和 IFN-α 上調、Myc 活性和較高的顆粒酶表達，均表明 T 細胞活化。同時，它們表達較高的免疫檢查點分子水平，包括已批準的靶點 PDCD1 和 CTLA4，但也包括目前臨床試驗中靶向的其他靶點（LAG3、TIGIT、HAVCR2/TIM3、CD27 和 TNFRSF9/CD137）（圖 5f）34。所有這些分子也與通過平均顆粒酶（GZMA、GZMB 和 GZMH）表達測量的 T 細胞活性相關（圖 5g），表明受高檢查點表達的限制。基質細胞在腫瘤中的分布及其與病人存活的關系
缺氧與腫瘤行為的許多重要方面相關，包括血管生成、轉移、代謝調控基因和免疫逃逸。因此我們將每個腫瘤分為3部分：腫瘤核心部位、中間部位和邊緣，探究癌細胞的分布情況。結果發現，在更缺氧的腫瘤核心的癌細胞比中間和邊緣更多；而大部分基質細胞在含氧量正常的腫瘤邊緣富集。圖b是距離腫瘤核心或邊緣距離與腫瘤細胞數量線性模型的T值，顯示腫瘤核心或邊緣富集基質細胞團。腫瘤細胞和缺氧兩個特性比較偏重分布于core和middle，而b圖中不同的基質細胞則偏重分布于edge
LUAD 中標記基因的平均表達（n = 501）或 LUSC（n = 513）樣本，在 TCGA 中使用 RNA-seq 進行表征。基質細胞類型顯示 > 2 倍的變化之間的表達兩種癌癥類型命名和突出。
42個細胞亞型中，只有9個細胞亞型的marker gene在LUAD和LUSC之間的表達有顯著差異。其中兩種亞型的表達差異可能反映了肺腫瘤的細胞起源，其中LUAD來源于AT2細胞，LUSC來自基底細胞。CD8 T-cell cluster 8和纖維原細胞 cluster 5可能反映了組織病理學的差異
此外，本文評估了TCGA數據庫中1572名病人（1027 LUAD和545 LUSC）的細胞亞型與病人存活率的關系。通過對患者年齡、性別和腫瘤時期等多變量校正分析發現，基質marker gene表達增加時LUSC病人的存活率下降，而非LUAD病人（Fig.6d）。如flat AT1 cells, respiratory epithelial cells and cross-presenting dendritic cells高表達時LUSC病人存活率降低，而CD8+ T-cells cluster 8正好相反。
小結
對5位肺癌患者共19個樣本進行單細胞轉錄組測序，并對另外3位患者進行單細胞測序驗證，證明了基質細胞之間存在很強的個體間差異，表明聚類得到的52種細胞亞型覆蓋了肺TME的大部分細胞異質性。當比較腫瘤和匹配非惡性肺時，許多基質細胞亞群都是由腫瘤衍生或肺組織衍生的細胞組成的，主要的細胞類型包括內皮細胞、成纖維細胞、B細胞、巨噬細胞、T細胞、肺泡細胞和上皮細胞。
對上7種主要基質細胞類型進行更詳細的研究，發現：腫瘤內皮細胞MHC I 、MHC II和ICAM1等基因表達下調，提示其抗原呈遞和免疫細胞歸巢能力被下調，從而促進了腫瘤的免疫耐受；肺腫瘤有五種不同類型的成纖維細胞，并且每一個纖維細胞類型都表達了一種獨特的膠原蛋白和其他細胞外基質分子；B細胞在腫瘤中有很強的富集，聚類顯示有9個亞群，包括高表達CD20的濾泡B細胞在內的6個亞群在中腫瘤中高富集，并且濾泡B細胞在腫瘤中耗盡處于耗竭狀態；在腫瘤中巨噬細胞表現出變阻表型并在腫瘤中形成M2極化；腫瘤T細胞轉錄組分析提示在CD8+腫瘤浸潤T淋巴細胞中促進脂肪酸分解代謝，可以增強了他們減緩腫瘤惡化的能力。
腫瘤核心中有更多的癌細胞，它們的缺氧程度高于邊緣樣本。研究不同基質細胞marker表達與TCGA數據庫中患者預后的關系時發現，肺鱗癌（LUSC）在較高的階段表現出許多基質成分的減少，而在腺癌（LUAD）中觀察到的與階段相關的變化很少，并且在LUSC中高基質標記表達和降低生存率相關。
原文鏈接
作者：珠江腫瘤
