空間轉錄組（ST）和單細胞轉錄組（scRNA-seq）的結合作為一個關鍵的組成部分，將人體組織的病理表征與分子改變聯系起來，確定了原位細胞間的分子通訊和時空分子醫學知識。2022年4月1日Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》發表綜述文章，概述了ST實驗和生物信息學方法的發展，并評估了其臨床和轉化應用價值。

ST為理解胚胎發育過程和定義特定發育器官、早期定位和遷移的關鍵基因提供了新的見解。與scRNA-seq相比，ST能更好地觀察發育的細胞譜系中的細胞位置和異質性。在ST技術的發展中，代表技術包括ProximID、seqFISH+、Stereo-seq、sci-Space、STARmap、10×Genomics Visium、Slide-seqV2、Seq-Scope等。??

文中描述了以下基于不同原理的ST技術，包括TIVA、FISSEQ、seqFISH、LCM、APEX-seq、NICHE-seq、LCM、APEX-seq、NICHE-seq、HDST和DBiT-seq。

空間轉錄組的生物信息學工具

與scRNA-seq聚類方法相比，ST需要對基因表達、空間位置和組織學信息進行更全面和綜合的考慮。ST的一個關鍵分析步驟是對斑點進行聚類，并確定基因表達譜和形態表型在空間上一致的區域?？臻g聚類方法分析基因表達的空間相關性，主要包括SpaCell、SpatialCPie、ClusterMap、FICT、SpaRTaCo、SC-MEB和CCST。??

空間變異基因（SVG）的識別對于確定細胞類型的位置非常重要。隨著ST分辨率的提高，已開發新的方法來檢測空間可變基因，例如GLISS、SpatialDE、SOMDE、trendsceek或SPADE。

在ST數據分析中，可以利用scRNA-seq數據推斷出每個點的細胞類型分布。為分析空間數據設計了多種細胞類型去卷積方法，如SPOTlight、spatialDWLS、DSTG、DestVI或STRIDE和RCTD。

對于缺乏單細胞分辨率的ST數據，每個點可能包含不同的細胞類型。通過參考鄰近斑點的信息或具有細胞形態和表型的高分辨率信息的圖像，可以提高分析的質量。提高基因表達分辨率的工具包括BayesSpace和XFuse。

細胞-細胞通訊調節各種生物過程，以維持器官/組織內細胞的生物功能和微環境穩態。配體-受體對用于探索組織內不同細胞類型之間以及同一細胞類型內不同細胞之間的scRNA-seq通信，而ST則提供空間水平上的細胞間通信信息。已開發了許多工具來識別細胞間通信，包括GCNG和SVCA。

ST在發育和疾病方面的應用潛力

ST主要用于揭示人和小鼠在神經科學、胚胎發育和病理學領域的細胞連接的全面信息、不同細胞類型之間的復雜調控網絡、細胞異質性和微環境穩態。此外，在斑馬魚、紅原雞、野豬、倉鼠和果蠅中繪制了一些組織的ST圖譜。

ST被廣泛用于分析組織的分子空間結構，并在臨床和生物學研究中創建生物分子圖譜。例如使用Slide-seq技術，以單細胞分辨率捕獲并生成小鼠和人類受試者的空間基因表達模式。STARmap分析了3D大腦空間的復雜性，在小鼠初級視覺皮層的30000多個細胞中使用了23個細胞類型標記。生物體的胚胎發育是一個復雜而動態的過程，其中的表達圖譜和分布由ST繪制。??

ST的另一個重要應用是研究腫瘤內的異質性，以精確了解腫瘤進展和治療結果。例如通過分析鄰近腫瘤區域間質腫瘤微環境中的基因表達梯度，對前列腺癌的腫瘤異質性進行重新分層。通過淋巴結活檢對黑色素瘤中近2200個組織結構域的轉錄組進行研究，以可視化組織內的轉錄景觀，并確定特定組織區域的基因表達譜。ST結合機器學習從乳腺癌ST數據中識別診斷生物標志物，以區分導管原位癌和浸潤性導管癌。導管癌的預測準確率為95%，浸潤性導管癌的預測準確率為91%。最近的ST保留了組織結構，并通過分析細胞間的相互作用反映了免疫反應。在靶向治療期間，癌癥患者需要快速準確地識別耐藥克隆和空間敏感生物標記物，以預測對免疫治療的反應。ST將為早期檢測組織內的基因表達和細胞相互作用提供機會，但是精確腫瘤學中細胞的精確分辨率和靈敏性需要進一步提高。

神經病學中的ST

神經系統ST為理解單個神經元的類型、位置、樹突結構、軸突投射和相應功能提供了新的見解。例如功能失調大腦的ST圖譜提供了有關腦細胞類型的發育或退化組織和位置的分子信息，以開發新的分子生物標記物/靶點，并了解腦疾病的新機制。使用Fiji “Analyze particles”插件和ST流程進行數據處理，使用具有分層生成概率模型的ST測量ALS患者的小鼠脊髓和死后組織的基因表達，區分早期小膠質細胞和星形膠質細胞之間的區域差異，并確定ALS模型和患者脊髓病理學之間轉錄途徑的干擾。在ALS誘導后，小鼠體內動態發現約11138個基因的空間分布，并從ALS患者的脊髓樣本中進一步發現9624個基因。這項特別的研究定義了基因表達在組織中的明確定位和多維分布，并描述了退行性疾病的新機制（圖5a,b）。

ST和scRNA-seq的結合是一種新的方法，可以動態和多維度地了解疾病的分子機制，并開發新類別的空間生物標志物。該組合被推薦為診斷疾病、監測疾病進展和治療效果，以及發現新類別的空間靶點藥物的有效途徑。這種結合可以描述血管海綿狀瘤中腦內皮細胞的轉錄多樣性和亞類，并確定在腦海綿狀畸形發展中的功能作用。最初發現血管生成性靜脈毛細血管內皮細胞和常駐內皮祖細胞可能是腦海綿狀畸形轉化的主要來源，而不是動脈內皮細胞。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種破壞性的神經系統疾病，逐漸喪失智力、認知和身體功能。從小鼠切片的ST圖譜中識別出AD相關基因，包括與應激反應和線粒體功能障礙相關的空間失調基因。在AD模型中，ST在早期淀粉樣斑塊周圍直徑為100微米的組織切片中顯示了富含髓鞘和少突膠質細胞基因的共表達網絡的轉錄變化，而在晚期，在補體系統、氧化應激、溶酶體和炎癥中顯示了共表達網絡的轉錄變化。通過無偏識別的空間定義特征和ST腦區分子圖譜可以解釋成年小鼠大腦回路和行為的結構-功能關系以及系統分類。對不同腦區空間基因的注釋為理解神經元結構、神經連接、中間神經元投射、突觸前和神經膠質相互作用提供了新的見解。成年小鼠大腦區域的空間組織包括用于映射和定位離散神經解剖區域的分子代碼。

胚胎發育中的ST

胚胎和干細胞譜系是探索組織模式和相應分子調控回路的范例。帶有scRNA-seq的ST為剖析胚胎發育過程中細胞組織的分子動力學、形態學和分子特性的差異以及譜系分配開辟了新的途徑。利用ST和scRNA-seq技術，對小鼠原腸胚植入后胚胎和發育的關鍵特征進行了體細胞發生過程的探索。人類胚胎心臟細胞類型及其分布和空間組織的綜合轉錄圖譜揭示了4.5~5周、6.5周和9周后的三個發育階段。使用Seurat軟件包進行數據處理，三個人類胚胎心臟樣本的ST圖譜顯示了人類胚胎心臟發育過程中約3115個個體點和10個心肌簇。從大約69個選定的靶基因中獲得了細胞類型、轉錄組和人類心臟發育的時空圖譜。通過結合ST、scRNA-seq和GO分析，它能夠更好地識別組織中每種細胞類型（圖6a）、心臟細胞類型特異性基因和相互作用網絡（圖6b）的位置分布和基因標記。通過使用10×Genomics Visium和Space Ranger軟件，ST結合scRNA-seq展示了人類腸道發育和形態發生的時空圖譜。在這項特別的研究中，從代表不同發育時間點和組織位置的17個胚胎中收集了77個腸道樣本，并根據關鍵標記基因的精細聚類注釋在隔室中確定了101個亞組。轉錄調控網絡的定位和示例如圖6c所示，以突出顯示每種細胞類型的關鍵調控網絡，并使用scRNA-seq重建細胞命運的“決策樹”，包括已知的發育調控因子、306個發育時程和44個調控網絡的位置變化。對整個腸道發育過程中的組織進行ST分析（圖6c），發現了scRNA-seq識別簇的時空位置、上皮隱窩絨毛的形成、間充質的分化、肌肉層的建立、血管系統的擴張、免疫定植和腸道相關淋巴組織的出現。每種類型的細胞都有特定的基因標記，其中一些在基因表達（圖6c）、腸細胞類型特定基因和相互作用網絡（圖6d）方面存在位置和時間點差異。這項特殊研究的杰出發現為理解新生兒疾病和腸道發育的遺傳缺陷提供了新的見解。

病理學中的ST

ST特征的3D圖像顯示了腫瘤和免疫細胞之間相互作用的異質性，以及浸潤的免疫細胞在不同位置的差異。使用機器學習模型，腫瘤和免疫相互作用的分析、描述和分層能力得到了高精度的提高。黑色素瘤淋巴結活檢的ST圖譜揭示了與組織學實體相關的腫瘤內空間成分的轉錄景觀和基因表達譜的異質性。靠近腫瘤區域的淋巴區的基因表達模式與腫瘤微環境相似。轉錄組圖譜的空間定位有助于我們了解腫瘤進展、轉移的分子機制，并確定治療靶點。牙周組織的ST圖譜顯示，炎癥區域特異性極性陰影的表達上調，這是慢性炎癥性牙周炎發病機制的一部分。成人心臟ST圖譜顯示心力衰竭患者胎兒基因表達的空間差異。

腫瘤內部和腫瘤之間的異質性與腫瘤亞克隆的擴展、基因的改變和腫瘤細胞在腫瘤微環境中的相互作用高度相關，并與腫瘤的進展和復雜性有關。繪制了各種疾病的ST圖譜，包括腦組織、脊髓組織、乳腺癌、皮膚惡性黑色素瘤、前列腺癌、牙齦組織、胰腺組織和人類心臟組織。圖5c,d,e,f分別展示了ST結合scRNA-seq等組合的方式應用于原發性胰腺導管腺癌、人類皮膚鱗狀細胞癌、前列腺癌、皮膚惡性黑色素瘤研究。

空間轉錄組在分析感染性疾病的發病機制中具有重要的應用價值。scRNA-seq與不同時間點的新生小鼠回腸和心臟組織的ST相結合，揭示了心肌炎感染發病的動態過程，不同細胞表型的空間異質性網絡，以及與病毒引起的細胞間相互作用的關系。

時空多組學和跨組學將為理解該疾病提供更重要和全面的見解。需要更多的措施來定義表達的靶蛋白的定量、時空定位、突變、剪接異構體和翻譯后修飾變異。由于樣品制備、質量控制、數據生成和解釋過程復雜，或成本高昂，時空技術在臨床上的應用仍然滯后。應進一步開發方法的新穎性和標準化，例如提高通量（每次實驗捕獲的斑點或細胞數量）和提高分辨率（每個細胞檢測到的基因數量）。空間跨組學是ST發展的一個新方向，需要在一個樣本中同時檢測染色體結構、染色質可及性、組蛋白修飾、DNA甲基化、轉錄組、蛋白質組、代謝和非編碼RNA?；谠朴嬎愫腿斯ぶ悄艿墓ぞ邔⑹箍茖W家能夠輕松、自由地解釋復雜的時空數據。隨著測序方法、文庫構建方案和化學試劑的快速發展，成本將降低，有效地使時空分子病理學成為臨床篩選、診斷和治療監測的候選方法。

炎癥性疾病中的ST

根據外部刺激、發育方向、腫瘤轉移階段和腫瘤微環境中的“界面”細胞狀態，組織中細胞簇和亞型以及相應基因的空間位置或自然狀態代表不同的信號濃度梯度。微環境中的空間細胞間通訊提供了有關器官和疾病發展中的生物功能、網絡和宿主-病原體相互作用的更詳細信息。例如ST描述了慢性炎癥性疾病引起的免疫細胞機制和組織多樣性，包括在類風濕性關節炎中過度表達CD3E、CXCL9、CXCL13和LTB。而在脊椎關節炎中，POSTN、COMP、CILP2和PRG4與較高的軟骨周轉率有關。

ST 臨床應用的潛在挑戰

由于基因表達在生物過程中以復雜的空間形式發生，因此了解疾病發生和發展的空間異質性以及開發用于定義基因/蛋白質/細胞類型和病變組織中精確位置的ST非常重要。精確選擇方法是優化呈現疾病特定分子相互作用圖譜的關鍵步驟之一。例如，利用scRNA-seq發現一種疾病相關的小膠質細胞與AD模型中的神經退行性疾病有關，而利用RNA-seq和smFISH確定了人類AD死后大腦中這種小膠質細胞類型在Aβ斑塊附近的位置，并與AD的起源密切相關。使用免疫組化染色驗證了細胞內Aβ顆粒數量的增加和疾病相關的小膠質細胞標記的陽性。這一發現為開發用于AD靶向治療的小膠質細胞激活藥物提供了一個機會。

ST圖譜顯示3D分子表型和描述信息，以及表達基因的身份、程度和位置。心力衰竭患者成人心臟活檢中胎兒基因的空間表達與胎兒心肌相似。胎兒標記基因的過度表達有助于人類心臟的重塑。根據肝小葉分帶中靶基因的空間表達，肝分帶是導致血管結構空間異質性和同一性的最重要因素。臨床前ST研究表明，在單細胞水平上，缺血神經元體細胞和軸突線粒體之間，以及內毒素血癥誘導的急性腎損傷中組織細胞之間存在細胞間通訊和功能障礙。這種基因表達的空間模式有助于我們理解異質性的發生和發展，包括微環境、腫瘤內和腫瘤間、復發、轉移和治療反應（圖7）。與scRNA-seq相比，ST圖譜提供了基因表達和細胞間相互作用的清晰定位，而兩者都屬于全面的描述性信息。與scRNA-seq不同，ST為分子機制的提出提供了空間表型的描述信息。

ST的臨床意義和應用高度依賴于ST圖譜的匹配性、可重復性和穩定性，以及疾病的復雜性、嚴重性、分期、病理學和結構準確性。在多細胞基因調控網絡的ST圖譜中，57個斑塊誘導基因在AD模型中逐漸構建了一個調控網絡。β-淀粉樣斑塊的沉積可能在疾病過程中起“觸發”或“驅動”作用，部分原因是多細胞協同作用的神經退行性機制。由于動物和人類之間以及模型和疾病之間分子圖譜和形態表型的差異，將臨床前ST圖譜轉化為臨床價值是一個挑戰。

綜合分析ST的復雜性和可重復性被視為臨床應用的技術限制。越來越多的證據表明，ST是了解人類疾病、監測分子信號和細胞間相互作用的空間異質性以及制定精確醫學策略的重要工具。ST分布依賴于組織切片在三維器官/組織中的位置和疾病進展的動態階段。由于不同水平和方向的組織切片之間存在巨大差異，因此，所選組織切片中ST分布的程度是否代表并涵蓋了多維器官的全部景觀和變化，這一點受到質疑。來自癌癥ST數據的分子特征可以對乳腺癌區域內的轉錄組相互作用進行分類，并為臨床理解和決策提供科學證據和支持。病理學識別和選擇的準確性對ST圖譜和相應的細胞間相互作用的可靠性和匹配性起著決定性作用。盡管ST圖譜在發現和識別疾病特異性和空間化特異性因素方面取得了進展，但構建和繪制空間圖譜的綜合分析還需要進一步標準化、自動化，并具有大范圍ST分析、減少方法學變異和更多潛在探索的特點。由于樣本收集、保存和運輸的困難，人類樣本的數量仍然有限，無法得出明確的結論。迫切需要對目標疾病進行系統、精心設計的臨床研究，并提供有關切面位置、疾病階段和嚴重程度以及干預措施的明確信息。ST目前影響著我們對組織結構中轉錄組調控和細胞間相互作用的理解和知識，而ST的長期影響應該通過整合ST與臨床表型的臨床應用來證明。

隨著新ST技術的快速發展，數據采集不斷改進，ST分辨率、靈敏度、通量量和可及性方面的挑戰正在被克服。ST與石蠟包埋組織相容，為生物庫中采集的樣本進行回顧性分析提供了可能性。這將有可能系統地檢測各種組織并重建生物體的三維空間結構基因表達。改進的ST將使我們進一步了解生物體的發育過程，并為臨床醫學中的早期疾病檢測和精確的靶向治療提供基礎。ST與多種技術的聯合應用將需要滿足臨床需求。因此，相信持續提高ST分辨率和單細胞分辨率的靈敏性將有利于臨床實踐和改善患者預后。

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參考文獻

Zhang, L., Chen, D., Song, D. et al. Clinical and translational values of spatial transcriptomics.Sig Transduct Target Ther 7, 111 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00960-w

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