原文來自：Dickson R P, Erb-Downward J R, Huffnagle G B. The role of the bacterial microbiome in lung disease[J]. Expert Review of Respiratory Medicine, 2013, 7(3):245.
新的不依賴于培養的技術最近已經證明，在健康中，被認為是無菌的下呼吸道，含有多種微生物群落：肺微生物群。越來越多的文獻表明，在健康和各種呼吸道疾病中都存在著一種獨特的下呼吸道微生物，盡管這些發現的生物學和臨床意義仍未確定。本文綜述了已發表的健康和疾病患者肺微生物區系、微生物多樣性和疾病構成的研究報告，并展望了肺外微生物群的假說和未來研究方向。
簡介
雖然肺部在歷史上被認為是健康無菌的，最初被排除在人類微生物組項目(HMP)的優先器官系統清單之外，但隨后的研究表明，下呼吸道充滿了健康和疾病狀態下的各種細菌群落。盡管肺外微生物群的研究起步較晚，但其研究領域正在迅速發展，并就肺微生物群與呼吸道疾病之間的關系發表了挑釁性的觀察結果(圖1)。對肺部微生物群的研究可能會為肺部感染的發病機制提供新的見解和途徑，肺部感染一直是世界范圍內疾病負擔的主要原因[1]，以及以前認為僅與微生物發病機制有間接關系的各種肺部疾病的發病機制。
在過去的十年中，新的不依賴于培養的微生物鑒定技術已經在我們對人體內和體內微生物細胞的豐富和多樣性的理解上得到了擴展，這些細胞統稱為微生物群。一個人擁有超過一萬億個細菌細胞，而一個人的微生物群中的基因數量是他/她的100[2]倍。常駐細菌在營養吸收、維生素合成、異物代謝、免疫調節、微生物紊亂等方面起著重要的作用，與感染、自身免疫、肥胖、心血管疾病和惡性腫瘤有關[3]。2008，國家衛生研究所認識到微生物組群在人類健康中的重要性，啟動了HMP，以確定人體和人體內細菌群落的特征，并探討其對健康和疾病的影響。本文將討論我們目前對以下幾個方面的認識：(一)分析微生物群的方法，(二)健康肺的微生物群，(三)特定情況下的病肺微生物群，(四)疾病狀態下觀察到的肺微生物群的一般主題，以及(五)肺外微生物體研究的經驗教訓、啟示和假設。
I.肺微生物群分析方法
現代分子微生物檢測技術的研究從未證實過健康個體下呼吸道的無菌性。傳統的觀點認為健康的肺是無菌的，這是從130年的定義，即從組織樣本上細菌在培養基上生長的能力。在肺炎等傳染病狀態中，細菌病原體或輔助因素甚至難以找到，在這些疾病中，75%的確診病人沒有發現病原體。考慮到人體內70%的細菌不能用標準的醫學微生物學培養基[5]培養，這些臨床觀察僅說明我們對健康和疾病期間肺部宿主微生物相互作用的理解不足。
許多現代細菌鑒定分子技術利用16 SrRNA基因的變異，這是細菌基因組中一個小而高度保守的位點，允許進行基因和物種水平的鑒定。高通量測序16S rRNA基因擴增產生的細菌生物樣品產生大量的短序列，隨后可以對和排序根據預定義的水平的同源性。然后根據公開可得的分類數據庫[6，7]對這些數據進行分類。利用這些原則，454焦測序和illumina測序等平臺能夠同時識別和量化多個組織樣本中的整個微生物群落[8]。(圖2)這些敏感和快速的技術，往往比傳統的文化相關方法更徹底和準確，在過去十年中，效率大大提高，成本降低。
目前，大多數肺微生物學研究都集中在肺內細菌群落的構成上，類似的技術可以用來描述病毒和真菌生物。病毒和真菌在急慢性呼吸道疾病的發病機制中都可能具有相當重要的作用，但迄今為止關于這一課題的文獻還很有限，超出了本文的研究范圍。靶向PCR技術已廣泛應用于呼吸道病毒和肺孢子蟲的臨床診斷。
到目前為止，大多數肺微生物分析都是在支氣管肺泡灌洗(BAL)液上進行的，或者在囊性纖維化的情況下，是在自發性痰中進行的。上氣道微生物群對痰或BAL標本中微生物含量的準確貢獻是一個有爭議的問題。通過無菌外科外植體獲得的肺組織的分析研究已經完成，所有的研究都表明下呼吸道包含一個不同于但與上氣道相關的微生物群[9-12]。有人提出了一種上呼吸道微生物(經支氣管鏡污染或圍術期微抽吸)的方法，即通過對上呼吸道標本[13，14]信號的去除，但這種方法既未得到驗證，也未得到普遍采用。一些研究人員建議采用中立生物多樣性理論[15，16]，以評估下呼吸道中檢測到的微生物是否是上呼吸道微生物群的直接延伸(在這種情況下，其相對濃度應反映上氣道微生物群)，或下呼吸道因素中的選擇性壓力是否有利于特定物種的相對豐度[17]。在這一概念框架內，“無效假設”是，沒有獨特的選擇壓力作用于細菌繁殖在下呼吸道，在這種情況下，細菌在BAL標本中的相對濃度應該與上呼吸道的細菌的濃度相當。BAL中大量存在的物種的存在將否定零假設(并且不符合“中性模型”)，這意味著在下氣道細菌物種有一個獨特的生態位。
在這些問題得到解決之前，不可能準確地比較下呼吸道和身體其他部分之間的細菌生物量，但肺泡和小氣道中細菌的濃度可能大大低于口或下消化道的細菌濃度，最多可與胃或小腸的細菌濃度相比[18]。這些低絕對水平的細菌生物量給該領域帶來了特殊的挑戰，即上呼吸道出現假陽性信號的風險，以及試劑或實驗室環境中出現的低水平信號的意外放大。為了解決這一問題，最近的研究不僅包括上呼吸道生物樣本，還包括支氣管鏡沖洗和試劑對照。
上述鑒定細菌的分子技術的一個重要方面通常不會在本質上區分死細菌和活細菌，而只是鑒定分析樣本中是否存在dna。這與傳統的依賴于文化的技術不同，后者需要有活的有機體。這是這些新技術應被視為對傳統微生物鑒定方法的補充，而不是替代方法的一個方面。
II. 健康肺的微生物群
胎兒的肺，就像胎兒的腸子一樣，被認為是無菌的，嬰兒的肺很可能在出生后獲得微生物群落。在分娩后即刻，嬰兒粘膜表面迅速被來自母親的微生物所填充(陰道分娩時的陰道和腸道微生物，Cesaerean切片中的皮膚微生物)[19]。嬰兒微生物群最初在不同的體位上是一致的，在隨后的幾天和幾周內被區分為特定地點的群落[20]。健康嬰兒肺微生物群的來源尚未研究，但最近對7例囊性纖維化嬰兒的縱向研究顯示腸道微生物群落與呼吸道微生物群落之間的一致性，證明胃腸道的時間優先[21]。
許多已發表的研究表明，使用BAL樣本[9，13，14，18，22-24]健康成人的肺微生物群。當分析門的相對豐度時，一致觀察到的最常見的門是：Bacteroides, Firmicutes 和Proteobacteria。BAL標本中描述的門與同期采集的上呼吸道(口咽、鼻)標本相似，但相對豐度不同(例如，放線桿菌的相對頻率)。健康對照組中的優勢屬為Prevotella, Veillonella, Streptococcus和Pseudomon。主動吸煙似乎改變了上氣道的微生物組成[25]；其對肺微生物群的影響尚不清楚。在比較英國和美國的標本[26]時，觀察了囊性纖維化患者痰微生物區系的差異，并報道了不同地理來源的人腸道微生物群有很大的地域差異[27]，但生物地理對正常肺微生物群構成的影響還沒有描述。
描述對照病人肺部微生物群的研究由于樣本量小和缺乏縱向研究而受到限制；截至2012年底，發表的研究中的對照對象總數為75人[9、13、14、18、22-24]，而來自同一對照者的系列標本尚未報告。肺HIV微生物組項目(LHMP)是一個正在進行的、多中心的NIH項目，旨在補充HMP，目的是通過在多個時間點研究許多沒有已知肺病理學的患者的肺部微生物群來解決這個問題。
III. 疾病肺的微生物群
a.囊性纖維化-自20世紀30年代首次描述以來，囊性纖維化(CF)一直與反復呼吸道感染[28]有關，而這種系統性疾病的發病和死亡的主要原因仍然是進行性氣道阻塞和相關呼吸道感染[29，30]。用培養技術檢測的常見病原體包括金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和隨年齡增長的銅綠假單胞菌。間歇性和最初(表面上)可根除的感染之后是培養可檢測的氣道定植，患者容易感染其他罕見的呼吸道病原體，如嗜麥芽窄食單胞菌和盲腸吸蟲復合體(Burkholderia Cepacia)。
近十年來，非培養微生物鑒定技術一直被用來表征CF患者的氣道微生物群，而CF的肺微生物群的報道比所有其他呼吸道疾病加起來的結果都要全面[10，23，26，31-58]。應用了多種分子技術，包括末端限制性片段長度多態性分析[23，26，31-35，39，44，47，49，57]，克隆文庫測序[31，32，36，38，42，45，46]，焦測序[10，42，47，48，50-52，58]，生理芯片[43]和光照[55]技術。大多數研究都是針對自然祛痰樣本進行的，很少使用BAL[31，35]和肺組織[10，23，46，48，54，56]。這些引文清單并不全面，并且強調了試圖描述下氣道微生物群落特征的研究。
分子方法揭示了CF氣道微生物區系以前未被認識到的復雜性，無論是在活動惡化期間還是在活動惡化之間。羅杰斯等人早期重要的觀察發現，活動性細菌性呼吸道感染患者的痰中含有大量的多種細菌[32，33，44]。隨后的研究再次證明了氣道定植和感染在CF中的多微生物特性，包括許多以前通過培養依賴技術而未被識別的物種。這一發現可能部分解釋了長期觀察到的痰培養、形態和敏感性結果與患者對抗菌藥物治療的反應之間的不一致[59]。這一觀察對急性和慢性使用抗生素治療的臨床意義尚不清楚，但它表明，與其“清除”感染，相反，使用抗生素改變了動態和異質微生物群落的內部結構。一項單一的研究發現非CF型支氣管擴張癥患者肺部的復雜性相當[54]，但尚未確定這些發現是否普遍適用于其他形式的肺部感染。
對CF肺微生物群的研究已經發現了許多以前未被承認的細菌，這些細菌在CF惡化、炎癥和氣道破壞中具有潛在的致病性。對厭氧物種[32-34]產生了特別的興趣，其共同的存在和生存能力隨后通過培養依賴技術得到證實[60]。目前還沒有發表的臨床試驗，無論是前瞻性的還是其他的，研究了針對這些微生物的靶向抗生素治療是否有益，其臨床意義尚未確定。
有幾項研究已經研究了肺微生物群的多樣性是否隨病情的時間或嚴重程度而變化。Cox等人采用縱向分析的方法證明，隨著氣道阻塞的年齡和嚴重程度，細菌群落多樣性降低；同一研究發現，純合子ΔF 508突變的患者與異種-ΔF 508患者和非ΔF 508患者相比，微生物多樣性降低[40]。Klepac-Ceraj等人還發現，隨著年齡的增長，微生物多樣性逐漸減少，并證實了全身和吸入抗生素對多樣性的負面影響[43]。在迄今公布的最大和最長期的CF氣道樣本中，趙等人顯示，隨著時間的推移，多樣性逐漸減少，但在輕度氣道疾病患者中相對穩定[58]。在這個系列中，最近抗生素的使用是微生物多樣性下降的最有力的預測因子。Stressmann et也觀察了抗生素治療對肺微生物學的直接影響。他觀察到抗生素前的群落結構似乎在抗生素暴露后一個月內恢復到顯著水平[57]。
最近，一項研究比較了對重癥晚期CF患者的移植肺組織、咽喉和痰標本進行的獨立培養分析，發現痰祛痰準確地代表了相對均一的下呼吸道中的優勢微生物，但夸大了非典型細菌種類的多樣性和代表性[10]。大多數下呼吸道樣本絕大多數由一至三種典型呼吸道病原體組成。作者提出了“減去”上呼吸道微生物群的方法。
兩個臨床試驗已經檢查腸道益生菌是否影響CF患者肺惡化的頻率和嚴重程度[61，62]。這些研究雖然規模較小，但都發現與對照組服用安慰劑[61]相比，肺部惡化的頻率顯著降低，與益生菌治療前后的研究對象相比[62]。這些發現必須在更大的試驗中驗證，然后才能推薦常規的臨床使用，但它們對療效的機制提出了挑釁性的問題。這兩項研究的作者都推測，減少腸道壁炎癥對肺部炎癥的間接影響可能會產生益處，但目前尚不清楚腸內益生菌如何影響肺微生物的組成。
b.哮喘和變態反應氣道疾病--兒童感染頻率的降低與哮喘和過敏的發展增加之間的聯系多年來一直被人們認識到，這就產生了“衛生假說”：早期感染的減少會導致粘膜耐受性紊亂和自身免疫病的增加[63]。多項研究發現，兒童早期抗生素暴露與哮喘和過敏的后續發展之間存在關聯[63，64]，推測正常微生物群的破壞可能與這些疾病的發病機制有關。
兩項重要的研究已經研究了哮喘患者與健康對照者肺微生物組的組成[18，24]。[18]Hilty等人比較了哮喘患者口腔、鼻腔和BAL標本與慢性阻塞性肺疾病患者和健康對照者的微生物群[18]。在哮喘患者中，作者發現與對照組相比，蛋白質桿菌的頻率增加，Bacteroidetes細菌的頻率降低。這種相對增加的Proteobacteriae細菌是由Haemophilus, Moraxella和Neisseria 導致的。
隨后，Huang等人將65例控制不良的哮喘患者的肺微生物(用保護標本刷獲得的支氣管微生物)與10名對照組進行了比較，發現哮喘患者的細菌負擔和細菌多樣性均有所增加[24]。他們證實了哮喘患者中Proteobacteriae細菌相對豐度的增加，并發現多種細菌的存在與支氣管高反應性的嚴重程度呈正相關。當使用克拉霉素時，在支氣管高反應性患者中發現了更大的多樣性，這是在肺微生物群構成與臨床干預的功能反應之間的罕見觀察之一。
除了肺部微生物群在氣道過敏性疾病中可能發揮的作用外，一個互補的假設是，由于抗生素的使用和西方地區的低纖維、高糖飲食而引起的胃腸微生物群組成的紊亂已經破壞了胃腸道微生物體介導的粘膜耐受機制。支持這一假說的數據包括工業化國家[65-69]哮喘/過敏與抗生素使用之間的相關性，以及糞便微生物群改變與特應性疾病之間的相關性[70-76]。在抗生素治療和無菌小鼠中對這一假說的直接測試支持了腸道微生物群的變化與肺部過敏反應之間的這種潛在聯系[77-79]。一些研究實驗了乳酸菌口服給藥對實驗性過敏性肺部炎癥的調節作用。
c.慢性阻塞性肺疾病-自早期現代描述以來，慢性阻塞性肺疾病(COPD)被推測至少是由慢性和反復呼吸道感染引起的炎癥引起的[80]。然而，呼吸道破壞與呼吸道定植/感染之間的因果關系方向仍然不確定，盡管已有幾十年的積極研究[81，82]。最近的一項試驗顯示慢性阿奇霉素對慢性阻塞性肺病(COPD)頻繁加重的患者有好處，引起了人們對肺/氣道微生物區系交叉、炎癥和不可逆氣道阻塞的重新興趣[83]。在過去四年中，有七項研究報告了COPD患者的肺微生物群[9，12，18，22，23，39，84]。除一名患者外，所有患者沒有呼吸道感染的積極證據和最近沒有使用抗生素，用于分析的樣本包括BAL[9，12，18，22]，移植的肺組織和痰排痰[39]。這些研究表明，COPD患者的下氣道和肺泡中含有明顯的微生物群，這可能與疾病的慢性進展和感染性惡化的間歇性發展有關。
Hilty等人對哮喘患者微生物群的早期研究包括5例COPD患者[18]。COPD患者標本的微生物區系與哮喘患者相一致，并與健康對照者不同，蛋白質細菌的相對存在量相似地增加，類桿菌的數量也相對減少。值得注意的是，與對照組相比，COPD標本中含有更多的嗜血桿菌，這是COPD加重期最常見的培養生物。
在隨后的一項研究中，Erb-down等人比較了在BAL和移植肺組織中發現的嚴重COPD患者與沒有肺病或阻塞性通氣功能障礙的吸煙者和非吸煙對照者的肺組織[9]。他們發現，16 SrRNA基因在他們的群體中的濃度是相當的，這就意味著他們的細菌負擔是相當的。氣道阻塞最嚴重的受試者微生物多樣性明顯降低，在屬級成員中存在廣泛的重疊現象。COPD標本中常見的屬為假單胞菌屬、鏈球菌屬、Prevotella屬和嗜血桿菌屬。作者分析了同一肺內多個部位的組織(來自移植受者移植的本地肺)，揭示了嚴重疾病患者肺內(甚至單個肺葉)內肺微生物的明顯區域異質性。
Sze等人還對手術獲得的肺組織標本進行了研究。[23]他發現COPD肺組織中細菌細胞數量較少，與對照組相比，差異無顯著性。COPD患者和對照組的多樣性明顯大于分析中的CF患者。與吸煙和非吸煙對照相比，COPD患者中發現了一種明顯的微生物群，蛋白質細菌和類桿菌的豐度相當，但與對照組相比，厚壁菌微生物數量增加。乳酸菌屬的增加推動了厚壁菌的增加。本研究與其他研究的一個重要區別是，分析的組織大部分可能是肺泡實體，而氣道包涵體相對較少，這可能解釋了所發現的相對豐度的一些差異。
Cabrera-Rubio等人通過對8例COPD患者痰痰標本、支氣管吸入液標本、BAL標本和支氣管粘膜活檢標本的分析，研究了8例COPD患者的呼吸微生物群[12]。他們觀察到與以前的研究(蛋白質細菌、細菌、放線桿菌和第一菌)相同的門，其中鏈球菌、Prevotella、Moraxella、嗜血桿菌、不動桿菌、鐮刀菌和奈瑟菌在這些屬中占很大比例。他們發現BAL中的微生物區系與支氣管粘膜標本具有一致性，但隨著類桿菌和厚壁菌的頻率的增加，上呼吸道標本(支氣管吸痰和祛痰)的微生物多樣性降低。
Pragman等人用焦測序法比較了22例COPD患者和10例對照組BAL的微生物區系，發現COPD患者的微生物多樣性增加，且與梗阻程度呈正相關。COPD和對照標本中最常見的門是放線菌、纖支桿菌和蛋白桿菌。這項研究的一個重要貢獻是認識到BAL樣本的微生物區系不僅與疾病狀況有關，而且還與吸入支氣管擴張劑和/或吸入皮質類固醇有關。這一觀察，結合吸入糖皮質激素與嚴重肺炎發生率增加有關的臨床觀察[85]，應有助于進一步研究吸入藥物對肺微生物區系的影響。
一項單一的研究探索了COPD患者急性加重期呼吸標本的微生物區系[84]。Huang等人研究了8名因COPD加重而導致呼吸衰竭的機械通氣患者。與其他COPD研究的對象不同，這些患者都是在樣本采集之前接受了最近的抗生素治療。盡管如此，在分析的氣管內吸氣液中發現了令人印象深刻的微生物多樣性。機械通氣時間對所鑒定的微生物區系構成有影響，作者鑒定了所有標本中有75個細菌類群和27個細菌科的“核心”，包括假單胞菌科、腸桿菌科、彎曲桿菌科和螺旋桿菌科。本研究的一個重要參數是，受試者來自于呼吸道標本中培養的銅綠假單胞菌的大量插管患者。
d.肺移植-肺移植受者的死亡率和移植物功能障礙仍然高于所有其他實體器官移植的死亡率和移植物功能障礙，大多數發病率可歸因于感染或毛細支氣管炎閉塞癥(BO)和毛細支氣管炎閉塞綜合征(BOS)：小氣道慢性纖維增生，導致進行性、不可逆轉的氣道阻塞。雖然發病機制尚不清楚，但微生物感染/定植與BOS之間存在多種關聯[86-88]。肺移植會導致呼吸道宿主防御系統發生許多變化，從而改變肺部的微生物區系，包括氣道結構的扭曲、本土淋巴通道的中斷以及抗排斥藥物的全身免疫抑制。
Charlson等人最近發表了一項研究，將來自23例肺移植受者的BAL標本的微生物群與6名非移植對照組的樣本進行了比較[89]。他們發現移植受者的微生物多樣性下降，在一些情況下，單一物種(如銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌)的存在非常普遍。在這些情況下，通常在常規培養中也能發現優勢菌的特征。作者還對移植受者BAL中真菌種類進行了分析，發現有豐富的念珠菌和曲霉菌種。微生物組群組成與臨床特征如急性或慢性排斥反應之間的重要聯系尚未報道，目前仍不清楚。Borewicz等人隨后的一份報告發現，與兩個對照組相比，移植受者之間的多樣性有所增加，移植門以蛋白質細菌門的Burkholderaceae科為主[90]。這一家族在任何一個對照標本中都沒有被發現。在BOS發生前后，作者沒有發現微生物群的明顯聚集。
e.特發性間質性肺炎-一項單一的研究描述了特發性間質性肺炎患者的微生物群[91]，這是一種慢性彌漫性肺部疾病的異質性類型。用變性梯度凝膠電泳等方法對20例肺間質性疾病(特發性肺纖維化、非特異性間質性肺炎和急性間質性肺炎)患者BAL中的微生物群落進行了分析。兩種典型的呼吸道病原體(如流感嗜血桿菌)和各種以前未被識別或未被識別的生物體都已被確認。挑釁性地觀察到肺孢子蟲的存在與細菌負擔之間存在負關聯，提示肺孢子蟲與細菌之間可能存在體內拮抗作用。
機械通氣-除了上述黃等人關于慢性阻塞性肺病加重期的研究[84]外，弗拉納根等人僅有一份報告描述了機械通氣患者呼吸標本的微生物群[92]。在Huang研究中，根據呼吸培養中是否存在機械通氣和銅綠假單胞菌的情況，選擇了入選患者，限制了所有通氣患者的通用性。作者注意到在使用廣譜抗生素期間呼吸微生物的多樣性明顯下降，通常伴隨著優勢生物的重組(通常是銅綠假單胞菌，盡管同時使用抗假單胞抗生素)。進一步的縱向分析可能有助于揭示抗生素和其他急性干預措施對肺部動態微生物群落的影響。
IV.呼吸系統疾病的一般主題
a.時間和空間的異質性-至今還沒有發表的研究描述了健康對照的一系列呼吸道標本的縱向分析，因此“正常”肺微生物體的相對穩定性或動態性質尚不清楚。到目前為止，對肺部微生物標本的縱向分析幾乎都是對CF患者的痰標本進行的[40，49，50，52，57，58]，這可能不能準確地反映他們下氣道的微生物區系[10]。在發表的縱向研究中，個別病人痰中的微生物群落隨著時間的推移相對穩定，盡管出現臨床惡化和抗生素的使用[52，58]。由于痰分析的局限性和CF獨特的臨床特征，從這些觀察中推斷出任何關于健康和其他呼吸道疾病中微生物群穩定性的結論還為時過早。如上所述，正在進行的LHMP將包括非疾病患者的連續取樣，并應提供更多關于肺微生物學的時間穩定性/動態的信息。然而，肺環境連續采樣的深度/精度(與連續糞便采集腸道環境的連續采樣相比)將始終是一個問題，除非未來的技術進步允許反復對下氣道進行無創微生物群分析。
在考慮微生物群落空間變異的兩項研究中，嚴重COPD[9]和重度CF[48]的空間異質性顯著。目前還不清楚這一發現是否是特定于這兩種疾病的末期，這兩種疾病的特征都是局部粘膜間隙受損，或者其他疾病的肺部在空間上是異型的。
對上呼吸道和下呼吸道同時取樣的樣本進行比較的研究發現，上呼吸道標本中擬桿菌和葉放線菌的相對豐度增加，但微生物群落相似，但有明顯區別。這些結果表明，呼吸道并不像傳統上討論的那樣，是由離散和獨立的間隔組成的。一個更精確的模型是，呼吸道是一個單一但內部異質的生態系統，從鼻翼延伸到肺泡，其中包含一個連續的、不斷變化的微生物地形。來自上氣道的微生物很可能通過直接的粘膜延伸和睡眠時的微吸入不斷地進入下氣道，這是普遍存在的，通常是無癥狀的[93]。來自下氣道的微生物通過纖毛運輸和咳嗽不斷進入上氣道，即使在沒有呼吸道癥狀的患者中，這種情況每天也會發生多次[94，95]。呼吸道特定部位微生物群落的組成可能是這些影響以及溫度、氧分壓、pH、營養密度、局部宿主防御和種內及種間小分子信號等生長條件的綜合作用。
b.疾病的多樣性和嚴重程度--微生物多樣性與呼吸道疾病的存在和嚴重程度之間的明確趨勢迄今尚未在發表的研究中出現。在慢性阻塞性肺病(COPD)中，據報道肺微生物群的多樣性與對照組相比增加[22]、減少[9]和相應的[23]。對肺移植受者BAL樣本進行的類似分析發現，[90]增加了和減少了[89]多樣性。這些相互矛盾的結果表明，單個受試者肺微生物群的多樣性可能是多因素的，不能被解釋為其疾病嚴重程度的一個簡單功能。在某些疾病狀態中，使用抗生素[43，58，92]，年齡[40，43]和CF基因型[40]影響多樣性。進一步的研究，特別是縱向取樣，有望發現其他多樣性的驅動因素，并揭示其臨床意義。
c.新病原體的鑒定--肺部微生物群研究的一個直接和短期目標是應用分子技術，通過培養技術來識別以前不被或過度重視的呼吸道病原體。我們對“病原體”、“污染物”和其他已鑒定的微生物之間的區別有了進一步的了解，這包括：1)新認識健康肺中的常駐細菌；2)在活動性感染狀態下，識別與已知病原體同時存在的病原體；3)缺乏機械動物模型；4)缺乏縱向數據或臨床試驗。根據環境的不同，一個特定的微生物可能與其宿主有著完全不同的關系：在健康的穩態中，宿主與微生物的相互作用可能是互利的或中性的，但當穩態被破壞，微生物超越其生態位并通過毒力因子或通過激活宿主免疫間接造成組織損傷時，則是致病性的。僅是對活動性感染患者肺部微生物DNA的鑒定，僅僅是我們對肺部感染發病機制的認識的第一步。
考慮到這些注意事項，并承認大多數上述回顧性研究排除了有活動性感染的患者，一些研究已經在有臨床感染證據的患者的呼吸道標本中確定了大量可能未被識別的呼吸道病原體的濃度。其中大部分是在囊性纖維化文獻[35，36]中收集的，其中收集到的大部分痰要么是活動惡化的背景，要么是病人與已知的致病微生物“定居”后收集的痰。新的候選病原體包括利索桿菌、立克次體、利莫蘇斯、肺孢子蟲和豬鏈球菌等。特別是厭氧菌，如Prevotella和Veillonella屬，其共同存在已通過培養技術[60，96]，已確定這些微生物的濃度相當于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的濃度。如上所述，這些發現必須被理解為可能受到上呼吸道污染的限制[10]，迄今為止還沒有發表臨床試驗來檢查治療這些潛在病原體的有效性。
在少數幾項非CF研究中，包括有臨床證據表明有活動性感染的患者，非培養技術證實了由基于培養的技術檢測的物種占肺微生物群主要成分[92]，但同時存在許多其他具有不確定意義的生物體[84]。鑒于上述關于慢性肺病患者和非慢性肺病患者在未主動感染時肺微生物構成差異的觀察，我們對“病原體”定義的理解可能需要修訂和擴展。
V. 肺外微生物群研究的經驗教訓、意義和假設
肺微生物學研究領域對其他器官系統微生物區系的研究具有并行性和類比性的優點，其中許多器官系統在人體、種群和動物模型水平上已經被研究多年。對肺外微生物群的研究結果進行了綜述，揭示了肺微生物學研究的潛在方向。
a. 修正簡單化和過時的定義---腸道、皮膚和泌尿生殖道微生物群落的調查人員已不再將所有常駐微生物簡單地稱為共生微生物(從宿主或向其提供益處)或病原體。我們對幽門螺桿菌的理解是一項信息豐富的案例研究：雖然胃曾經被認為是無菌的(如肺)，但在許多受試者中(通過改進的診斷技術)顯示胃含有大量的幽門螺桿菌，與消化性潰瘍病和胃惡性腫瘤的發展有很強的關聯[97]。然而，隨后的研究揭示了幽門螺桿菌(Hp)與食管反流[98]和哮喘[99]之間的顯著負相關關系，以及根除幽門螺桿菌與肥胖之間的機械聯系[100]。這種生物最準確地被認為是一種“兩棲動物”，一種與宿主有關系的常駐微生物，視環境而定，可被認為是共生的或致病性的[3]。目前尚不清楚這種“兩棲動物”是否屬于肺微生物學中描述的物種，以及哪些局部和系統因素可能影響它們與宿主關系的性質。
除了完善我們對個體微生物命名的理解之外，對微生物群的研究還應該促使我們重新審視我們對什么是傳統意義上的“感染”、“定植”和“健康”(即傳統理解中的下呼吸道無菌)的理解。這些術語顯然不足以解釋迄今為止肺微生物群的發現。一種更好的理解將主動感染和“健康”肺微生物群的多樣性置于一個連續體的兩端，在不同程度的“失調”中分離出來，如細菌性陰道病和炎癥性腸病。該模型將主動感染(如細菌性肺炎)理解為“正常”肺微生物群復雜的穩態破壞的一種緊急現象，而不是以前無菌室中侵入性有機體的不受抑制的生長。要全面描述肺部感染，就需要了解宿主肺部微生物群的組成及其抗擾動能力，這是科赫的假設[101]傳統中缺失的一種元素。
b.“肺型”--近年來，人們一直致力于定義在人類腸道中聯合在一起的細菌群落，它們是腸道微生物區系的特征“指紋”：“腸型”。在2011年的一項重要研究中，Arumagam等人描述了三種不同的腸道微生物群，它們的組成不同，地理位置不特定[102]；隨后的一項研究表明，腸道腸型可能受飲食的影響[103]。腸型的臨床意義尚不確定，Arumagam等人隨后的分析表明腸道微生物群在不同的腸道類型中存在較多，而在不同的腸型中則較少[104]。但是，在隨后的研究(特別是LHMP)中，一個重要而容易回答的問題是肺微生物群中是否存在類似的“肺型”，以及它們是否有助于進一步“表型”復雜和異質性疾病，如COPD。
c.肺內宿主微生物與微生物相互作用的機制--對人類腸道微生物群和動物模型的研究表明，微生物影響宿主炎癥和微生物耐受性、宿主營養和藥物代謝的機制以及微生物群落相互溝通和相互影響的方式，發現了許多發現。腸道微生物群與粘膜免疫的界面是動態的雙向通訊。宿主免疫介質包括粘液層等物理屏障、上皮細胞分泌抗菌肽和產生微生物特異性IgA的復雜細胞免疫；反之，腸道微生物通過內毒素信號介導淋巴成熟、介導上皮修復、影響Th1/Th2平衡，并能促進本地微生物的粘膜耐受性[105]。大多數這些相互作用都是通過目前描述良好的小鼠腸道微生物群模型得到澄清的；由于在肺微生物學研究領域缺乏類似的模型，因此排除了對肺微生物區系的任何這樣的觀察。然而，我們已經觀察到，小鼠腸道微生物群的紊亂會影響過敏性氣道疾病的易感性[106]；這在多大程度上是全身免疫改變的結果，而不是GI和肺微生物群之間更直接的相互作用。
最近的研究還揭示了細菌和宿主通過類似人類激素的小分子進行交流的多種機制，并影響細菌群體感應、宿主上皮細胞基因的表達和微生物毒力因子的激活[107]。長期以來，人們都知道許多微生物分泌抗菌肽；事實上，我們臨床上可用的大多數抗生素最初都來自于細菌或真菌生物。這些觀察表明，要全面了解肺微生物學體，就需要對微生物與微生物的相互作用進行研究，有可能作為上述“肺型”的中介。
d.微生物群對未發病人群的影響-微生物群紊亂與大腸癌[108109]和類風濕關節炎[110]之間的關系，以及一些可能的致病機制，都被描述為與微生物無典型性相關。到目前為止，還沒有發表的研究對原發性肺癌或自身免疫性肺病患者的肺微生物群進行了研究。由于我們才剛剛開始了解疾病狀態對微生物群的影響，因此肺微生物群不應被認為與任何疾病狀態都無關，盡管它與我們對微生物發病機制的傳統認識有著間接的聯系。
** e. 微生物學作為治療目標-如果一個紊亂的肺微生物群被證明參與了疾病的發病過程(而不是偶然和次要的精神錯亂)，它將作為一種新的治療干預靶點而引起人們的關注。肺微生物群，就像其他組分一樣，有可能被操縱，目的是通過使用益生菌(為了健康而使用的外部微生物)、前生物制劑(促進特定細菌生長的非吸收分子)、抗生素和群體感應分子抑制劑來糾正失調和恢復“健康”微生物群落。
迄今為止，研究口服益生菌在胃腸道疾病中應用的臨床試驗在預防抗生素相關性腹瀉[111]和治療急性感染性腹瀉[112]方面最為有力；對于難治性抗生素難治性難治性感染患者，腸道微生物群移植已顯示出治愈的巨大希望[113]。這些表明，在肺部疾病中，有針對性的微生物群治療最合適的早期目標可能是那些具有直接感染成分的疾病，如肺炎和支氣管擴張癥。
事實上，已經發表了幾項關于腸內給藥益生菌的肺部效應的研究，并取得了有希望的結果[114]。在2010年對146名機械通氣患者的研究中，益生菌的使用顯著降低了呼吸機相關性肺炎的發展速度(40%比19%)[115]。許多研究已經檢查了口服益生菌在預防上呼吸道感染方面的作用，大多數研究(17/21)都有益處[116]。以上討論的兩個小的隨機對照試驗顯示接受益生菌治療的患者CF惡化的頻率降低[61，62]。在這些研究中，是否通過直接改變肺微生物學區或通過腸粘膜介導的全身免疫效應間接傳遞益處，尚不得而知。
如腸內微生物移植治療艱難梭菌的案例所示，給藥途徑在有針對性的微生物群干預中非常重要。吸入或直接在肺內注入益生菌或益生菌可能會對肺微生物菌群產生與腸內給藥截然不同的影響。
除了對肺部微生物群落的戰略性操作之外，我們還可以借鑒微生物所使用的上述分子中介物的研究經驗，以相互溝通，并宿主上皮細胞和炎癥細胞。居民微生物可能已經產生了真正的小分子藥典，可以影響局部和全身炎癥、黏膜耐受性、氣道反應性以及微生物的協同和拮抗作用**。
專家評論
現代獨立于培養的微生物識別技術已經徹底改變了我們對居住在呼吸道的細菌群落的理解，無論是在健康狀態還是在各種疾病狀態下。肺微生物群的構成與臨床主要結果之間的重要聯系已經被觀察到，進一步的研究有望闡明肺部感染和慢性肺部疾病的發病機制。這一領域將促使研究人員重新考慮長期以來關于健康和疾病呼吸道中微生物與宿主之間復雜和動態關系的觀點。
五年展望
目前肺微生物學的研究還處于起步階段，目前的研究大多局限于小樣本、缺乏縱向樣本和對照對象。我們預計，在未來幾年，以下發展將使我們對肺微生物學及其在人類疾病中的作用的理解更加成熟：
