從山中四因子OSKM中排除 Oct4 可以釋放 iPSC 的發育潛力
Excluding Oct4 from Yamanaka Cocktail Unleashes the Developmental Potential of iPSCs - PubMed (nih.gov)

亮點

• SKM 可以在沒有外源性 Oct4 的情況下在體細胞中誘導多能性
• SM 共表達激活體細胞中的逆轉錄病毒沉默機制
• Oct4 過表達在重編程期間驅動大量脫靶基因激活
• OSKM，而不是 SKM，iPSC 顯示出異常的印記和分化模式

摘要

Oct4 被廣泛認為是四個 Yamanaka 重編程因子中最重要的一個。在這里，我們展示了 Sox2、Klf4 和 cMyc (SKM) 的組合足以將小鼠體細胞重編程為誘導多能干細胞 (iPSC)。在成纖維細胞中同時誘導 Sox2 和 cMyc 會立即觸發逆轉錄病毒沉默，這解釋了與先前研究的差異，這些研究試圖但未能使用逆轉錄病毒載體在沒有 Oct4 的情況下生成 iPSC。 SKM 誘導可以部分激活多能網絡，即使在 Oct4 敲除的成纖維細胞中也是如此。重要的是，在沒有外源 Oct4 的情況下重新編程會大大提高 iPSC 的發育潛力，這取決于它們在四倍體互補試驗中產生全 iPSC 小鼠的能力。我們的數據表明，重編程過程中 Oct4 的過表達導致重編程過程中的脫靶基因激活和所得 iPSC 的表觀遺傳畸變，從而對 iPSC 技術的進一步開發和應用具有重大意義。

背景

自從山中伸彌（Shinya Yamanaka）突破性地發現轉錄因子 (TF) 驅動的重編程（Takahashi 和 Yamanaka，2006 年）以來，多項研究已經解決了重編程雞尾酒中每個成分的功能（Li 等人，2010 年；Malik 等人，2019 ；Soufi 等人，2012；Sridharan 等人，2009；Tsankov 等人，2015）。 Yamanaka 實驗室的后續工作表明，在重編程混合物中的四種 TF——Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc (OSKM)——中，只有 cMyc 可以省略，同時仍然允許產生誘導多能干細胞 (iPSC) (Nakagawa 等人, 2008)。此外，盡管 Sox2、Kfl4 和 cMyc 可以被其 TF 家族的其他成員取代，但 Oct4 不能被 Oct1 或 Oct6 取代。已經進行了許多嘗試來替換重編程混合物的成分，以了解每個因素的分子作用，并可能提高重編程技術的效率和安全性（Radzisheuskaya 和 Silva，2014 年）。

盡管許多研究表明重編程雞尾酒中 Oct4 的替代可能性（表 S1），但 Oct4 仍然是生成 iPSC 的常用分子。事實上，我們和其他人已經證明，單獨的 Oct4 的外源表達足以重編程固有表達其他重編程因子的細胞類型（Kim 等人，2009a，2009b；Tsai 等人，2011；Wu 等人，2011 ）。大多數可以成功重編程為 iPSC 的 Oct4 替代物通過直接激活內源性 Oct4 基因發揮作用（Buganim 等人，2012；Gao 等人，2013b；Heng 等人，2010；Shi 等人，2008） .在體內，Oct4 作為主要調節劑，在維持多能性（Niwa 等人，2000；Pesce 和 Sch?ler，2001）和在發育過程中建立內細胞團（Nichols 等人，1998）方面發揮著不可或缺的作用。

最近有趣的研究描述了與 Oct4 無關的重編程雞尾酒，其中 Oct4 被 GATA 因子取代（Montserrat 等人，2013；Shu 等人，2013，2015）。Shu等人假設 Oct4 和 Sox2 可以通過分別抵消彼此在中內胚層和神經外胚層分化中的影響來協調重編程過程中的細胞去分化。該報告表明，與 Oct4 相比，Gata3、Gata4 和 Gata6 等內胚層譜系指定因子促進了更高效率的重編程。此研究介紹了多能性的“蹺蹺板模型”，將其描述為在誘導相反發育譜系間的精確平衡（Shu and Deng，2013）。

我們團隊之前確定 Oct4 對于在小鼠發育過程中建立全能性并不重要。此外，核移植后，Oct4-null 卵母細胞仍然可以有效地將體細胞核重編程為多能性（Wu et al., 2013）。目前的工作是由一個令人驚訝的觀察引發的，即不包含 Oct4 的重編程盒能夠有效地產生 iPSC，這與長期以來的教條相反。

實驗結果

• SKM足夠重編程小鼠體細胞多能性

Figure 1. Sox2, Klf4, and cMyc Can Reprogram to Pluripotency in the Absence of Exogenous POU Factor
圖1.在沒有外源POU因子的情況下，Sox2、Klf4和cMyc可以重新編程為多能性
(A和C)從OKSM(A)和OSKM(C)重編程BOX獲得的KSM和SKM多順反子載體的方案。
(B和D)分別用Teto-KSM(B)和SKM(D)載體產生IPSCs。KSM和SKM IPSCs原代集落和傳代克隆系的相差顯微鏡和熒光顯微鏡圖像(標尺為250 mm)。
(E)分別在KSM和SKM IPSC系中驗證Teto-KSM和Teto-SKM轉基因，同時確認沒有Oct4或Brn4整合。
(F)對MEFs、KSM和SKM iPSC系中Oct4、Nanog和Col1a1啟動子中DNA甲基化的亞硫酸氫鹽測序分析。
(G)畸胎瘤切片的H&E染色，顯示三層胚層(外胚層：角化上皮；中胚層：平滑肌肉；內胚層：立方上皮和呼吸上皮)。
(H)從SKM IPSC系產生的成年嵌合小鼠。
(I)Bright-field和GFP合并的E13的KSM和SKM IPSC嵌合胚胎的性腺圖像。
(J)時間進程重編程實驗的示意圖。
(K)使用多順反子質粒對Oct4-GFP MEF進行時程重編程實驗。103個轉導的MEF被放置在飼養層細胞上，并用DOX誘導，持續指定的天數。10dpi計數GFP+集落數。誤差條表示SD；n=3。
(L)轉導多順反子載體后MEF的蛋白質印跡分析，1 dpi

最初，我們從廣泛使用的 tetO-OKSM 多順反子重編程盒 (Sommer et al, 2009) 中移除 Oct4生成一個負對照來比較不同 POU 因子的重編程能力（圖 1A）。令我們驚訝的是，在 Oct4-GFP 報告小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF) (OG2) 中誘導 KSM 仍然可以產生 GFP+ 菌落（圖 1B）。

然后，我們也從 tetO-OSKM 質粒中刪除了 Oct4（Carey 等人，2009、2010、2011；圖 1C）。早在誘導后 5 天（dpi），SKM 盒也產生 GFP+ 和堿性磷酸酶陽性菌落（圖 1D 和 S1B）。PCR基因鑒定證實SKM/KSM慢病毒整合到所有IPSC系中，而沒有檢測到Oct4轉基因或另一種POU因子Brn4(圖1E)。

KSM/SKM(以下簡稱SKM)IPSCs具有胚胎干細胞(ESCs)的形態特征，可擴增至少15代(圖1B和1D)。多能特異性標記SSEA1和Nanog染色陽性(圖S1a)。亞硫酸氫鹽處理的DNA的甲基化分析顯示，Oct4和Nanog啟動子是低甲基化的(圖1F)，表明多能性基因的表觀遺傳激活。相反，在重新編程的細胞系中，Col1a1啟動子高度甲基化，表明體細胞基因沉默。SKM IPSCs在畸胎瘤形成分析中產生了所有三個胚層(圖1G)，并促進了可存活的嵌合小鼠的發育(圖1H)，包括生殖系(圖1I)。

SKM重編程與表達載體或起始細胞類型無關

為了評估SKM重編程與OSKM重編程的效率和動力學，我們進行了時間進程重編程實驗。用OSKM、SKM、OSK、OKM或OSM多順反子載體轉導OG2 MEF，并用多西環素(DOX)誘導1-8天(圖1J)。SKM在誘導至少5天后產生GFP+克隆，與OSKM相比延遲了2天(圖1K)。誘導后6-8天的SKM重編程效率約為OSKM的30%。令人驚訝的是，從OSKM中移除Oct4的危害最小，而移除KLF4導致重新編程效率下降最大。Western印跡分析證實了類似的因子表達和沒有從每個組合中消除的因子(圖1L)。使用具有Gof18；ROSA26-rtTA背景的MEF得到了非常相似的結果(圖S1B)。

我們排除了TET誘導啟動子或反向四環素控制的反式激活因子(rtTA)在沒有Oct4的情況下啟動了重編程的可能性，因為我們證明了EF1a-SKM/KSM在沒有rtTA的情況下可以產生GFP+克隆(圖S1C)。我們還將KSM克隆到非整合的游離載體中，以嘗試無病毒的重編程(Okita等人，2011年)。將游離KSM進行脂質體轉染導入MEF產生GFP+克隆，這些克隆擴增成穩定的IPSC系(圖S1D)，第五代失去了載體(圖S1E)。我們通過免疫染色和畸胎瘤檢測證實了無整合KSM-IPSCs的多能性(圖S1F和S1G)。

為了解決SKM重新編程是否依賴于特定的起始細胞群體的問題，我們轉導了預分選的THY-和Thy+亞群的MEF，發現兩者都可以重新編程，盡管在Thy+細胞中誘導SKM可以產生更多的GFP+克隆(圖S1H-S1J)。我們還證明了在沒有外源Oct4的情況下，成人肺成纖維細胞(圖S1K)、永生化的成人尾尖成纖維細胞(圖S1L)和皮質星形膠質細胞(圖S1M-S1P)可以被重新編程。總體而言，SKM重編程的效率似乎與細胞分裂的速度有關，而與細胞的來源無關。

Oct4缺失時的重新編程依賴于高細胞增殖率

Figure 2. Highly Proliferative Cells Can Be Reprogrammed by Sox2 and Klf4 Alone
圖 2. Sox2 和 Klf4 單獨可以重新編程高度增殖的細胞
(A) 用分離的 KSM 和 SKM 盒重新編程 Oct4-GFP MEF。通過用三種濃度的 dox 誘導獲得不同水平的轉基因表達：1 μg/mL (H)； 50 ng/mL (M);和 10 ng/mL（L；參見 tetO-mCherry 面板，右）。在 7 和 14 dpi 后計數 GFP+ 菌落。誤差線代表 SD； n = 3;比例尺代表 250 毫米。
(B) 14 dpi 后 Sox1-KM 和 Sox2-KM iPSC 的明場和 Oct4-GFP 合并概覽圖像（比例尺代表 1 毫米）。
(C) 使用 Sox2KM 或 Sox1-KM 多順反子盒結合 Oct4、Gata4 或 Gata6 對 Oct4-GFP MEF 進行重新編程。通過用 1 μg/mL 或 50 ng/mL dox 誘導 12 天實現不同水平的轉基因表達。在 D14 計數 GFP+ 菌落。誤差線代表 SD； n = 3。
(D) 通過異位表達 Sox2Klf4 雙順反子盒結合 Oct4、cMyc、Gata4 或 Gata6 對 SV40LT 永生化 Oct4-GFP MEF 進行重編程。誤差線代表 SD； n = 3。使用Student‘s t 檢驗計算統計顯著性。
(E) 細胞增殖試驗。在 96 孔板中用指定的構建體轉導 MEF。在 0、2、4 和 6 dpi 后收獲細胞并計數。 SK樣品用作計算統計顯著性的對照。誤差線代表 SD； n = 3。使用Student‘s t 檢驗計算統計顯著性。

為了進一步了解驅動 SKM 重編程的組件，我們剖析了重編程盒。我們發現 KS 和 SK 都不能單獨重新編程，但是當與 Oct4 或 cMyc 結合時，每個都可以產生 GFP+ 菌落（圖 2A）。我們使用三種不同濃度的 dox 來誘導不同水平的重編程因子表達。盡管即使是最低表達水平（10 ng/mL dox）也足以進行 OSKM 重編程，但在沒有 Oct4 的情況下重編程需要更高水平的表達（50 或 1,000 ng/mL dox）。因子的多順反子表達似乎對 SKM 重編程有益，但并不重要，因為 SK+M、KS+M、K+SM 甚至 S+K+M 都可以產生 GFP+ 集落，盡管在單順反子誘導的情況下效率非常低。 Klf4-IRES-Sox2 (KS)+M 可以產生效率與 KSM 相當的 iPSC，不包括可能由未切割的 2A 肽引起的多蛋白獲得功能效應的可能性 (Velychko et al, 2019)。

據報道，內胚層特異性 GATA 因子可以替代 Oct4 重編程為多能性，而外胚層特異性 Sox1 或 Sox3 可以替代 Sox2 (Shu et al, 2013, 2015)。我們用 Sox1 替換了 Sox2，觀察到 SKM 和 OSKM 雞尾酒的重編程效率僅降低了 50%（圖 2B 和 2C）。添加 Gata4 或 Gata6 并沒有顯著提高 Sox2-KM 或 Sox1-KM 在高水平轉基因表達的重編程效率，但在較低誘導水平下增加了 GFP+ 菌落的數量（圖 2C）。

我們接下來測試 Gata4 或 Gata6 是否可以僅與 SK 結合重新編程。事實上，正如 Shu 等人 (2013) 所報道的，SK+Gata4/6 可以生成 iPSC；然而，重編程效率比 SK+O 或 SK+M 低 10 倍（圖 S2A 和 S2B）。此外，當用較低的 dox 濃度誘導時，SK+GATA 不會產生任何 GFP+ 菌落（圖 S2A）。

鑒于 GATA 因子、Oct4 和 cMyc 共享激活增殖基因的能力，我們接下來懷疑單獨的 SK 是否可以重新編程高度增殖的細胞。我們將 tet 誘導型 SV40 大 T 抗原 (SV40LT) 慢病毒載體引入 MEF，使我們能夠在重編程過程中可逆地使成纖維細胞永生化（Anastassiadis 等，2010）。起始 MEF 的永生化允許僅使用 SK 重新編程，并導致添加 cMyc、Gata4 或 Gata6 對于提高效率無效（圖 2D、S2C 和 S2D）。 SK iPSCs（圖 S2E）可以傳代至少 12 次，同時保留正常核型（圖 S2F）。我們通過 PCR 基因分型驗證了它們的基因組整合，并通過免疫染色、畸胎瘤形成和嵌合體貢獻（包括生殖系）驗證了它們的多能性（圖 S2G-S2K）。

通過重編程過程進行的細胞增殖試驗表明，添加 Gata4 或 Gata6 顯著增加了成纖維細胞的增殖，與單獨的 SK 相比，6 dpi 后細胞數量增加了 2 倍（圖 2E）。因此，我們得出結論，當與 SK 結合時，GATA 因子可以通過以類似于 cMyc 和 SV40LT 的方式增加增殖率來重新編程成纖維細胞。

SKM iPSC 展現出顯著增強的發育潛力

Figure 3. Omitting Oct4 in the Reprogramming Cocktail Increases the Quality of iPSCs
圖 3. 在重編程組合中省略 Oct4 可提高 iPSC 的質量
(A) 四倍體互補實驗示意圖。
(B) 使用 SKM#1 iPSC 細胞系通過四倍體互補測定產生的所有 iPSC 幼崽。將 23 個聚集體轉移到 2 個假孕 CD-1（白色）雌性。
(C) 本研究中產生的 4N-on 與 4N-off iPSC 和 ESC 與已發布數據的總比率。
(D) 源自 tetO-OSKM、SKM/KSM iPSC 或 ESC 的 4N 聚集胚胎百分比，這些胚胎產生足月幼崽、開始呼吸的幼崽、在寄養護理中存活至少 48 小時的幼崽以及存活的幼崽的百分比到成年（至少 3 個月）。條形代表所有測試線之間的平均值。統計顯著性通過 Mann-Whitney 檢驗確定。誤差線代表 SEM。
(E) 用 SKM#1 iPSC 系通過四倍體互補測定產生的 6 個月大的全 iPSC 小鼠。
(F) 分別對 SKM 和 KSM all-iPSC 小鼠的 F1 后代進行 SKM 或 KSM 轉基因的 PCR 基因分型。

接下來，我們通過對多能性最嚴格的測試——四倍體 (4N) 互補測定進行來評估 SKM iPSC 的發育潛力（圖 3A；Nagy 等，1990）。在這種方法中，測試的 iPSC 與 4N 胚胎聚集在一起，這些胚胎可以形成胚胎外組織，但不能形成可行的內細胞團。這種聚集體的發育導致胎兒幾乎完全由 iPSC（全 iPSC 小鼠）組成。

我們測試了來自 Gof18-Rosa26-rtTA MEF（5 個 SKM、3 個 KSM 和 5 個 OSKM 系）的 13 個克隆 tet 誘導 iPSC 系，這些系是平行生成和培養的。所有測試的系都經過預選，以最大限度地減少轉基因泄漏，以避免可能的有害發育影響（圖 S3A）。此外，我們從通過交配 SKM#1 all-iPSC 小鼠獲得的 F1 胚胎生成對照 ESC 系，以實現最接近的匹配基因型。所有 SKM iPSC 系都能夠產生足月全 iPSC 幼崽（4N-on；圖 3B 和3C;表 S2)。相比之下，5 個 OSKM 系中只有 3 個是 4N-on（圖 3C），證實了已發表的報告（Amlani 等人，2018；Buganim 等人，2014；Chen 等人，2015）。令人驚訝的是，44.1% ± 9.1% 的 SKM iPSC 和 27.1% ± 17.5% 的 ESC 聚集胚胎產生了完全發育的幼崽，而 OSKM iPSC 的這一比例僅為 2.3% ± 1.4%（圖 3D）。

OSKM 系的 4N 互補效率與其他報告的相當（圖 S3B），而 SKM iPSCs 的效率遠高于 OSKM iPSCs 或由替代雞尾酒——Oct4+Tet1 (OT) 或 Sall4+Nanog+ Esrrb+Lin28 (SNEL) 產生的 iPSCs——據報道可提高 iPSC 質量（Buganim 等人，2014；Chen 等人，2015；圖 3D 和 S3B）。值得注意的是，沒有一個 OSKM 全 iPSC 幼崽在寄養護理中幸存（圖 S3B），而 49.5% 的 SKM 全 iPSC 幼崽在寄養護理中存活至少 2 天，34% 存活到成年（圖 3D）。所有成年 SKM all-iPSC 小鼠均健康且可生育（圖 3E 和 3F）。此外，我們測試了 6 個由游離型載體生成的無整合 iPSC 系（圖 S1D-S1F）。結果基本一致：所有測試的游離型 KSM (epiKSM) iPSC 系均為 4N-on，而 3 個 EpiKSM+O 系中只有 1 個為 4N-on，盡管質量很高（圖 3C；表 S2）。與 tet-誘導系相比，附加型的變異性更高，這是由于游離型質粒消失的隨機性，因此缺乏因子表達控制（Okita 等，2013）。盡管如此，高質量的 epiKSM+O 系的出現表明，即使在 Oct4 存在的情況下，某些條件，例如較低的表達、快速的載體消失或特定的 O:KSM 比率，也可以產生高質量的 iPSC。

總之，SKM 雞尾酒產生的 iPSC 具有極高的發育潛力，比 OSKM 高近 20 倍，這表明外源性 Oct4 對 iPSC 的質量產生不利影響。

Sox2 和 cMyc 的共表達導致成纖維細胞中的逆轉錄病毒立即沉默

Figure 4. Co-expression of Sox2 and cMyc Leads to Immediate Retroviral Silencing in MEFs
圖 4. Sox2 和 cMyc 的共表達導致 MEF 中的逆轉錄病毒立即沉默
(A) OSKM 和 SKM 重編程期間 pMX-mCherry+ Oct4-GFP MEF 的時間過程 FACS。
(B) 表達 Oct4、Sox2、Klf4、cMyc 的 pMX-mCherry+ MEF 的 FACS 分析，以及克隆到 tet 誘導型多順反子載體中的因子組合，其中 IRES-Puro 在 D3 誘導和嘌呤霉素選擇。
(C) 實驗設計以跟蹤使用 OSKM 或 SKM 以 3 dpi 進行逆轉錄病毒沉默或未經歷逆轉錄病毒沉默的細胞的命運。
(D) 使用 OSKM 或 SKM 對 pMX-mCherry+ Oct4-GFP MEF 進行重新編程。細胞在 3 dpi 后被分選為 mCherry，并鋪在飼養層上。在 7 和 14 dpi 后計數 GFP+ 菌落。誤差線代表 SD； n = 3。使用學生 t 檢驗計算統計顯著性。
(E) 時程 SKM 與 OSKM 重編程 RNA-seq 實驗的實驗設計。
(F) 熱圖顯示基于 RNA-seq 數據的時程重編程樣本之間的 Spearman 相關系數。
(G) 描述 OSKM 或 SKM 誘導后基因表達的相對倍數變化 (FC) 的熱圖。所選基因被報告為系統性 siRNA 篩選中的前 100 個命中，用于在多能干細胞中重新激活逆轉錄病毒（Yang 等，2015）。層次聚類基于歐幾里得距離。

我們假設基于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的載體的早期沉默可能解釋了許多出版物中提出的矛盾數據，這些出版物報道了山中雞尾酒中 Oct4 的必要性（表 S1）。人們普遍認為，逆轉錄病毒轉基因的沉默是多能細胞而非體細胞的一個顯著特征（Hochedlinger 和 Plath，2009）。

我們用表達 mCherry 的逆轉錄病毒 pMX 載體轉導 OG2 MEF，以跟蹤重編程過程中的逆轉錄病毒沉默。令人驚訝的是，SKM 和 OSKM 誘導的成纖維細胞的形態變化與早在 2 dpi 開始的 mCherry 信號丟失相吻合（圖 4A、S4A 和 S4B）。后來，mCherry-細胞形成圓頂狀菌落，其中出現 Oct4-GFP+ 細胞（圖 4A 和 S4B）。我們量化了 OSKM 和 SKM 重編程期間的時間過程熒光激活細胞分選 (FACS) 分析的結果（圖 S4C）。雖然一半的成纖維細胞在 2 dpi 后已經失去 mCherry 表達，但三分之一的 mCherry+ 細胞仍表達成纖維細胞特異性 Thy1，但大多數在 4 dpi 時變為雙陰性。這些數據表明，逆轉錄病毒沉默在慢病毒驅動的重編程過程中很早就發生了——甚至在體細胞身份喪失之前。

如果這種立即沉默發生在逆轉錄病毒介導的重編程過程中，它將阻止成纖維細胞轉化為 iPSC。事實上，當 pMX-mCherry+ 細胞被逆轉錄病毒 Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc 感染時，一些細胞組失去了 mCherry 表達并停止了重編程（圖 S4D）。 GFP+ 細胞只能從不斷表達轉基因的 mCherry+ 簇中產生。因此，使用基于 MMLV 的載體重編程會選擇不經歷早期逆轉錄病毒沉默的細胞。

我們分解了 tetO-OSKM 盒，以確定驅動早期逆轉錄病毒沉默的確切因素。我們將重編程因子克隆到攜帶 IRES-Puro 的 tet 誘導型載體中，從而可以選擇受感染的細胞。雖然單獨誘導時沒有任何因素可以觸發沉默，但 Sox2 和 cMyc (SM) 的同時表達足以在 3 dpi將大多數細胞中的逆轉錄病毒轉基因沉默（圖 4B）。

我們追蹤了經歷或未經歷早期逆轉錄病毒沉默的細胞的重編程命運。我們在 SKM 或 OSKM 誘導和選擇后對 d3 的細胞進行分類，并將細胞種在飼養層上以評估它們的重編程命運（圖 4C）。總的來說，mCherry-對于兩種重編程條件，種群產生的 GFP+ 菌落數量明顯高于 mCherry+ 種群。雖然在 OSKM 重新編程的情況下，相同數量的 mCherry-細胞產生的 GFP+ 菌落是 mCherry+ 細胞的 4 倍，在 SKM 的情況下，mCherry-的菌落比 mCherry+ 多近 50 倍（圖 4D）。因此，我們證實逆轉錄病毒沉默發生在重編程的早期，這與 SKM 誘導特別相關。總之，這些結果表明逆轉錄病毒驅動的 SKM 重編程不可行（圖 S1C）。

重新編程 48 小時后逆轉錄病毒沉默機制已經建立

為了更深入地了解 SKM 重編程的機制，我們在重編程過程中進行了 RNA 測序（RNA-seq）（圖 4E）。 pMX-mCherry+ OG2 MEF 用多順反子 SKM 或 OSKM 轉導；在 2、4、6、9 和 12 dpi 后收集樣本。只有mCherry-細胞用于 RNA 分離以減少異質性并消除未轉導細胞的污染。此外，我們對在第 6 天（mCherry-/GFP-/Epcam+）或在第 9 天和第 12 天（dox 戒斷后 2 天）經歷間充質到上皮轉化 (MET) 或激活內源性 Oct4 (mCherry-/GFP+) 的重編程中間體亞群進行了測序；圖S4E)。以 Spearman 相關性作為距離度量的全局層次聚類顯示 iPSC 和 d12 樣本聚集在 ESC 附近，遠離起始 MEF，而 d2-d9 樣本聚集在兩者之間（圖 4F）。

此前，Yang 等人 (2015) 進行了全基因組小干擾 RNA (siRNA) 篩選，揭示了在多能干細胞中介導逆轉錄病毒沉默的成分。我們分析了樣本中與逆轉錄病毒沉默有關的前 100 個基因的表達。值得注意的是，通過 SKM 或 OSKM 誘導的 d2，該基因子集的表達已經與 ESC 的表達相似（圖 4G）。在 d2 上調的基因中有逆轉錄病毒沉默的關鍵驅動因素：組蛋白伴侶（Chaf1a/b 和 Smarcc1）、SUMO 化因子（Sumo2、Ube2i、Sae1、Uba2 和 Ube2j2）和染色質修飾者（Trim28、Setdb1 和Mphosph8)。因此，我們得出結論，多能細胞中逆轉錄病毒阻遏物機制在 SKM 或 OSKM 誘導的 2 天左右，可以在成纖維細胞中建立。

在體細胞中啟動多能性程序不需要 Oct4

Figure 5. SKM Can Activate Pluripotency Program in Oct4-KO MEFs
圖 5. SKM 可以激活 Oct4-KO MEF 中的多能性程序
（A 和 B）在 OSKM 和 SKM 重編程期間指示的成纖維細胞（A）和 MET（B）基因的時程表達圖。對于 d6 和 d9，僅顯示 Epcam+ 和 GFP+ 分類樣本，分別。
(C) MEF 和 ESC 特異性基因的時程表達 (Chronis et al, 2017)。僅繪制了具有 FC >=4 的差異表達基因 (DEG)。
(D) OSKM 和 SKM 重編程期間指示基因的時間過程表達圖。
(E) Oct4、Nanog (ChIP-Atlas) 和 Sall4 (Lim et al, 2008) 目標在 ESC 中的時程表達。僅繪制了 5 kb DEG（iPSC 與 MEF 中的 FC >=4）內的頂峰（macs 得分 >= 200，在 Chip-Atlas 上）。
(F) qPCR 基因表達分析 Nr5a2、Nanog 和 Sall4 后短發夾 RNA (shRNA) 驅動 KD 在 2 dpi 后用 OSKM 重編程期間。 ActB 用作參考基因。誤差線代表 SD； n = 3。
(G) 重編程 Oct4-GFP MEFs，表達 Nr5a2、Nanog、Sall4，或用 OSKM 或 SKM 控制 shRNA。在 7 和 14 dpi 后計數 GFP+ 菌落。誤差線代表 SD； n = 3。使用student' t 檢驗計算統計顯著性。
(H) 生成 Pou5f1 (Oct4)-KO MEF 的策略。
(I) PCR 基因分型確認 3 個 MEF 系中 Oct4 的純合缺失。
(J) 7 dpi 上用 SKM 重新編程的 Oct4F/F 和 Oct4D/D MEF 的免疫熒光成像。
(K) Epcam+ Oct4F/F 和 Oct4D/D MEF 在 7 dpi 上用 OSKM 或 SKM 重編程的 qPCR 基因表達分析。誤差線代表 SD； n = 3

為了比較 SKM 和 OSKM 重編程的分子路線圖，我們分析了與已建立的重編程階段相關的基因表達：成纖維細胞身份喪失；MET；和多能性的成熟（Li et al, 2010; Polo et al, 2012; Stadtfeld et al, 2008）。 RNA-seq 數據顯示，成纖維細胞特異性基因（Snai1、Thy1、Ncam1 等）的下調早在 OSKM 或 SKM 表達的 d2 開始，并且在兩種情況下同步進展（圖 5A 和 5C）。因此，成纖維細胞特性的喪失似乎與外源性 Oct4 表達無關。 MET 發生在 OSKM 的 d2-d4 和 SKM 重編程的 d2-d6 上，從上皮標志物的上調可以看出（例如，Cdh1、Epcam 和 Esrp1；圖 5B）。在沒有 Oct4 的情況下部分延遲的 MET 與我們的 FACS 數據一致，顯示 SKM 與 OSKM 相比，6 dpi 上的 Epcam+ 細胞較少（圖 S4E）。

重編程的成熟階段，以多能特異性基因的上調為標志，在很大程度上延遲了 SKM 重編程（圖 5C）。表達式圖證實 SKM 中不存在 Oct4，并且 SKM 與 OSKM 樣本中的 Sox2 水平相似（圖 5D）。盡管某些基因（例如，Lin28a、Nr5a2 和 Ccnb1）在兩種情況下都具有可比的動力學上調，但其他基因在沒有 Oct4 的情況下被延遲（例如，Nanog、Tfcp2l1 和 Esrrb）。 Oct4 直接目標的激活（圖 5E），例如 Fut9（SSEA1）和 Utf1（圖 5D），在 SKM 與 OSKM 重編程中延遲時間最長，而 Nanog 和 Sall4 目標顯示的延遲動力學較少（圖 5E）。

為了了解內源性Oct4在SKM重編程過程中是如何被激活的，我們用3個候選因子Nr5a2、Nanog和Sall4(圖5F)進行了基因敲除(KD)實驗，根據RNA-seq數據，這些實驗顯示相對較早的上調。這三個因素以前都被報道為重新編程中的Oct4替代品(Buganim等人，2012年；Heng等人，2010年)。Nr5a2 KD不影響SKM重新編程的效率(圖5G)。另一方面，Nanog或Sall4 KD顯著減少了SKM iPSC集落的數量，但對OSKM重新編程的影響要小得多。時間歷程免疫染色證實，在重新編程過程中，SKM在Oct4之前激活了Nanog(圖S5A)。

結合KD實驗的基因圖譜表明，Nanog和Sall4是SKM重編程過程中第一個被激活的多能性調節子，盡管內源性Oct4在第二次激活波中上調。為了進一步了解內源性Oct4在SKM重編程中的作用，我們制備了Oct4敲除(KO)成纖維細胞(圖5H)。取Oct4flox/flox；Rosa26-CreERT2小鼠的MEF用他莫昔芬處理，并用Teto-SV40LT永生化。選擇克隆性MEF以確保Oct4等位基因的純合缺失(圖5I)。免疫組織化學染色顯示，在Oct4完全缺失的情況下，SKM的誘導可激活Nanog和Sall4(圖5J)。7dpi后對Epcam+細胞的qPCR分析表明，SKM可以下調Oct4-KO MEF中成纖維細胞特異性基因(Thy1和slug)，并激活Met(Epcam和CDh1)和多能性基因(Nanog、Sall4、Lin28和Tfcp2l1)(圖5K)。然而，一些晚期多能性基因(如Esrrb和REx1)僅部分上調，Oct4-KO 的SKM 前-IPSCs時期進行DOX戒斷不能存活，這表明Oct4仍然需要完成多能性的建立和維持。

Oct4 過表達使細胞從直接途徑轉向多能性

為了比較 OSKM 和 SKM 重編程期間發生的全局基因表達變化，我們進行了二維降維方法：主成分分析 (PCA) 和 t 分布隨機鄰居嵌入 (t-SNE)分析（圖 6A、6B 和 S6A）。如前所述（Polo 等人，2012），PCA 表明 OSKM 重編程細胞在 PC2 維度中從直接途徑暫時轉向 d6、d9 和 d12 上的多能性，甚至在 PC3 維度中部分重新獲得 MEF 身份（圖6A 和 S6A)。相比之下，SKM 重編程沿著更直接的 PC2 軌跡發生，并進一步從 PC3 中的 MEF 轉移。 t-SNE 分析顯示 SKM 和 OSKM 樣本之間的區別更加明顯，從 4 dpi 開始。

據報道，成纖維細胞中的 SKM 誘導導致外胚層基因表達升高，這可以被 Oct4 或 GATA 因子抵消，從而導致多能性誘導（Shu 等，2013）。然而，其他研究表明，OSKM 重編程也會導致外胚層基因的瞬時升高（Gonza′ lez 和 Huangfu，2016；Mikkelsen 等，2008）。我們比較了 SKM 與 OSKM 重編程對外胚層、中胚層和內胚層基因表達的影響。中胚層基因在 OSKM 或 SKM 誘導后迅速下調（例如，Snai1、Snai2 和 Chrd），這與成纖維細胞身份的喪失相吻合（圖 6C）。

內胚層基因在整個重編程過程中基本上不受影響；然而，與 Shu 等人 (2013) 的報告相比，許多外胚層基因在 SKM 和 OSKM 重編程過程中都會瞬時上調。此外，OSKM 引起更強的外胚層誘導（例如，Krt1、Evpl 和 Nes），