首次揭示 SLC22A12 可能是抑制 ccRCC 進展的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物

Low Expression Levels of SLC22A12 Indicates a Poor Prognosis and Progresses Clear Cell Renal Cell Carcinoma

SLC22A12的低表達水平表明預(yù)后不佳,進展為透明細胞腎細胞癌

發(fā)表期刊:Front Oncol

發(fā)表日期:2021 Jun 23

影響因子:5.738

DOI:? 10.3389/fonc.2021.659208

一、背景

????????腎癌,在肺部或腦部可發(fā)生致命的轉(zhuǎn)移,因此對人類健康構(gòu)成了重大威脅。腎癌主要包括腎細胞癌(RCC)、過渡細胞癌(TCC)和腎母細胞瘤。RCC大約占腎癌的4/5,而其他腎癌大多是TCC。

????????維持平衡對一個健康的身體來說是至關(guān)重要的,同樣的情況也發(fā)生在組成細胞中。發(fā)生復(fù)雜的細胞內(nèi)反應(yīng)以維持各種生物大分子的水平,包括多種酶,轉(zhuǎn)運蛋白,激酶和細胞因子。上皮細胞生存的環(huán)境比正常細胞更復(fù)雜。由于存在物質(zhì)的活躍交換,代謝廢物的大量積累以及獨特的滲透壓差,因此維持細胞穩(wěn)態(tài)更具挑戰(zhàn)性。在適應(yīng)這種惡劣環(huán)境的過程中,上皮細胞已經(jīng)開發(fā)出一種克隆策略來取代去角質(zhì)的細胞。該策略有助于導(dǎo)致異位失調(diào)、腫瘤發(fā)生和蛋白表達譜差異。

????????研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)載體家族22成員12(SLC22A12)是一個組織特異性基因,在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。SLC22A12也被稱為尿酸鹽轉(zhuǎn)運體1(URAT1)或腎臟特異性轉(zhuǎn)運體(RST),是一種位于腎臟近端小管上皮細胞中的膜蛋白。

二、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

1) 數(shù)據(jù)收集自TCGA、cBioPortal for Cancer Genomics、UCSC Xen和ICGC,包括腎臟腎透明細胞癌(KIRC)患者的基因表達數(shù)據(jù)集及臨床信息。

2) ccRCC組織樣本:120對ccRCC及其相鄰的正常腎臟組織;從16對中提取的蛋白質(zhì)通過免疫印跡試驗進行分析;從20對樣本中提取的RNA通過qRT-PCR進行分析;兩對組織通過IHC進行分析;三對組織通過全轉(zhuǎn)錄組測序進行分析

3) 細胞培養(yǎng):人腎近端腎小管上皮細胞系HK-2,以及從ATCC購買的五種人腎細胞癌細胞系,包括786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1

2.實驗流程

1) 篩選涉及ccRCC細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因:細胞平衡的基因集從GO下載;腎臟特異性基因組從人類蛋白質(zhì)圖譜中收集;差異表達基因集由 "limma "軟件包獲得;SLC22A12的泛癌譜是由GEPIA收集

2) 免疫印跡試驗(IBT)、RNA提取和qRT-PCR、免疫組織化學(xué)(IHC)檢測

3) 細胞實驗:瞬時轉(zhuǎn)染過度表達和敲除SLC22A12、菌落形成試驗、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)試驗、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK8)試驗、細胞遷移和侵襲試驗

4) 生物信息學(xué)分析:SLC22A12表達的中位數(shù)被設(shè)定為將患者分為高表達和低表達組的分界點;GSEA

三、實驗結(jié)果

01 - SLC22A12是一個重要的腎臟特異性腫瘤抑制基因,維持細胞穩(wěn)態(tài)

????????這項工作的目的之一是確定ccRCC的細胞平衡的關(guān)鍵基因,作者篩選了三個獨立的基因組。TCGA數(shù)據(jù)集中的DEGs,腎臟特異性基因集,以及細胞穩(wěn)態(tài)基因集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有19個基因?qū)儆谶@三個基因集(圖1A)。接下來,進行了單變量的Cox回歸分析,以探索基因表達水平與患者生存率之間的關(guān)系。如圖1B、C所示,在所有19個基因中,只有SLC22A12、PTH1R、MT1G和SLC34A1的表達對總生存率(OS)和無病生存率(DFS)有明顯影響。多變量Cox分析(圖1D-K)和臨床病理數(shù)據(jù)證實,SLC22A12是OS和DFS的獨立風(fēng)險因素,具有更好的預(yù)后價值。除了兩個肉瘤樣本(SARC),沒有其他癌癥轉(zhuǎn)錄組資料包括SLC22A12(圖2A,B)。除此之外,SLC22A12只在腎臟中表達(KIRC:腎臟透明細胞癌;KIRP:腎臟乳頭狀細胞癌;KICH:腎臟染色體)。從上述結(jié)果來看,SLC22A12被選為進一步研究的主要基因。

圖1 篩選出參與ccRCC細胞平衡的關(guān)鍵基因

02 - SLC22A12下調(diào)與ccRCC的各種類型的臨床病理特征有關(guān)

????????從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了ccRCC組織和癌旁組織中SLC22A12 mRNA表達水平的數(shù)據(jù),以了解SLC22A12表達在腫瘤發(fā)生中的作用。結(jié)果表明,SLC22A12在腫瘤組織中的表達明顯低于癌旁組織(圖2C,D),在ICGC數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。此外,作者研究了SLC22A12表達與臨床病理特征之間的聯(lián)系,發(fā)現(xiàn)該基因表達的降低與原發(fā)腫瘤(T期)、區(qū)域淋巴結(jié)(N期)、遠處轉(zhuǎn)移(M期)、組織學(xué)分級(G期)和AJCC預(yù)后階段的增加有關(guān)(圖2F-M)。另外,女性的SLC22A12表達量較低(圖2E)。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中腎癌SLC22A12的轉(zhuǎn)錄組概況

????????應(yīng)用K-M生存分析和對數(shù)秩檢驗來確定患者的生存與SLC22A12表達之間的關(guān)系。從TCGA數(shù)據(jù)庫中,以SLC22A12 mRNA表達中位數(shù)為分界標(biāo)準(zhǔn),將522名ccRCC患者分為兩組。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SLC22A12表達量較低的一組,其OS和DFS最差(圖3A,B),ICGC-RECA隊列的生存數(shù)據(jù)顯示了類似的結(jié)果模式。關(guān)于SLC22A12在具有不同臨床病理特征的ccRCC患者中表達的K-M生存分析與之前的結(jié)果一致(圖3C-Q)。結(jié)果表明,SLC22A12在ccRCC中可能有預(yù)后價值,因為它的表達減少會導(dǎo)致患者的預(yù)后不佳。

圖3 SLC22A12 mRNA的低表達與ccRCC患者的不良OS和DFS有關(guān)

????????為了探索SLC22A12在ccRCC中的診斷價值,作者繪制了ROC曲線來評估患者的臨床病理特征。一般來說,利用SLC22A12的表達水平可以將ccRCC與正常組織適當(dāng)區(qū)分開來,TCGA-KIRC隊列的AUC為0.7258(圖4A),ICGC-RECA隊列為0.8926。此外,SLC22A12表達水平的診斷價值在臨床病理亞組之間進行了分析:男性對女性(圖4B);T1+T2對T3+T4階段(圖4C);N0對 N1期(圖4D);M0期與M1期(圖4E);AJCC I+II期與III+IV期(圖4F);G1+G2與G3+G4(圖4G)。結(jié)論是,SLC22A12可能是透明細胞腎細胞癌的潛在診斷生物標(biāo)志物。

圖4 SLC22A12的表達可能是ccRCC患者的一個診斷預(yù)測因素

03 - SLC22A12在ccRCC細胞和組織中下調(diào)

????????作者進行了qRT-PCR和IBT來驗證SLC22A12在RCC細胞中的表達水平。與正常細胞系HK-2相比,SLC22A12在RCC細胞系(786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1)中的mRNA和蛋白表達水平下降(圖5D,E)。相比之下,SLC22A12在ccRCC組織中的表達水平明顯高于其相應(yīng)的鄰近正常組織(圖5A-C)。RNA-Seq隊列也表明SLC22A12在腫瘤組織中下調(diào)(圖5F)。此外,來自癌癥/副癌癥的IHC結(jié)果表明(圖5G),SLC22A12主要位于癌癥和正常腎小管上皮細胞的質(zhì)膜上;然而,它在癌癥細胞中被下調(diào)。一般來說,這些結(jié)果共同表明,SLC22A12在腎癌細胞中表達不足。

圖5 與相應(yīng)的對照組相比,SLC22A12在RCC細胞和組織中呈下調(diào)趨勢

04 - SLC22A12限制了體外RCC細胞的增殖、侵襲和遷移

????????用SLC22A12質(zhì)粒或si-SLC22A12轉(zhuǎn)染RCC細胞系,研究SLC22A12對腎癌病理的功能。與相應(yīng)的陰性對照相比,ACHN和786-O細胞的mRNA和蛋白表達水平明顯增加或減少(圖6A-C)。在這兩個細胞系中,通過菌落形成(圖6D)、EdU(圖6E,F(xiàn))和CCK-8檢測(圖6G)分析了細胞活力,作者觀察到SLC22A12沉默促進了細胞增殖。此外,轉(zhuǎn)孔實驗驗證了SLC22A12的表達水平與細胞的遷移和侵入能力呈負相關(guān)(圖6H)。總之,這些結(jié)果提供了堅實的證據(jù),表明SLC22A12抑制了RCC細胞的增殖、遷移和侵襲,而這些在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。

圖6 SLC22A12在體外促進RCC細胞的增殖、遷移和侵襲

05 - SLC22A12參與了調(diào)節(jié)細胞平衡和ccRCC發(fā)病機制的多種生物途徑

????????利用TCGA-KIRC隊列進行多種功能富集分析,研究SLC22A12在ccRCC發(fā)病機制中的作用。如圖7A-C所示,激活的基因集與多個代謝途徑(圖7A)、細胞周期(圖7B)和腫瘤相關(guān)的信號通路(圖7C)有關(guān)。代謝途徑的富集,包括甘油脂、脂肪酸、葡萄糖,氨基酸和衍生物,和類固醇,表明SLC22A12對代謝物運輸?shù)淖饔靡部赡懿糠终{(diào)節(jié)代謝過程。腫瘤相關(guān)途徑的富集,包括Akt途徑,Wnt途徑,p53途徑,mTOR信號途徑,MAPK途徑,Hedgehog信號途徑和ERKs途徑,表明異常表達的SLC22A12可能激活各種癌癥途徑,促進ccRCC的發(fā)生或發(fā)展。通過IBT驗證了SLC22A12下調(diào)細胞中PI3K和Akt途徑的激活。GO和KEGG分析表明,SLC22A12參與了多種有機化合物、離子和激素的運輸,以及細胞外結(jié)構(gòu)的組織(圖7D,E)。

圖7 SLC22A12在ccRCC中的功能富集分析

????????為了進一步研究SLC22A12如何影響細胞平衡,作者用String數(shù)據(jù)庫進行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析,并選擇了20個具有最高可信度的蛋白質(zhì)。如圖S3所示,大多數(shù)的蛋白質(zhì)都與平衡狀態(tài)的維持有關(guān)。例如,SLC2A5和SLC2A9參與葡萄糖和果糖運輸;SLC38A3運輸氨基酸,而SLC5A8和SLC16A9運輸各種單羧酸鹽。另外,許多對物質(zhì)交換至關(guān)重要的離子泵也與SLC22A12有關(guān)。此外,大多數(shù)基因在腫瘤組織中的表達與正常組織不同,表明ccRCC的細胞平衡狀況完全不同(圖S4)。總之,SLC22A12可能與這些調(diào)節(jié)腫瘤細胞平衡的蛋白相互作用,從而影響細胞的增殖、侵襲和遷移。

圖S3 與SLC22A12相關(guān)的基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)
圖S4? TCGA-KIRC 隊列中基于 PPI 網(wǎng)絡(luò)的 SLC22A12 相關(guān)基因的熱圖?

四、結(jié)論

????????這是第一個證明SLC22A12的高表達水平與ccRCC患者的不良生存率和低臨床病理分期有關(guān)的研究。此外,SLC22A12的高表達水平可能降低RCC細胞在體外的增殖、遷移和侵襲能力。上述結(jié)果表明,SLC22A12是一個重要的腎癌生物標(biāo)志物,也是一個潛在的高度特異性治療目標(biāo)。SLC22A12的下調(diào)可能影響細胞的平衡,改變腫瘤細胞的生存。

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