Low Expression Levels of SLC22A12 Indicates a Poor Prognosis and Progresses Clear Cell Renal Cell Carcinoma

SLC22A12的低表達水平表明預(yù)后不佳，進展為透明細胞腎細胞癌

發(fā)表期刊：Front Oncol

發(fā)表日期：2021 Jun 23

影響因子：5.738

DOI:? 10.3389/fonc.2021.659208

一、背景

????????腎癌，在肺部或腦部可發(fā)生致命的轉(zhuǎn)移，因此對人類健康構(gòu)成了重大威脅。腎癌主要包括腎細胞癌（RCC）、過渡細胞癌（TCC）和腎母細胞瘤。RCC大約占腎癌的4/5，而其他腎癌大多是TCC。

????????維持平衡對一個健康的身體來說是至關(guān)重要的，同樣的情況也發(fā)生在組成細胞中。發(fā)生復(fù)雜的細胞內(nèi)反應(yīng)以維持各種生物大分子的水平，包括多種酶，轉(zhuǎn)運蛋白，激酶和細胞因子。上皮細胞生存的環(huán)境比正常細胞更復(fù)雜。由于存在物質(zhì)的活躍交換，代謝廢物的大量積累以及獨特的滲透壓差，因此維持細胞穩(wěn)態(tài)更具挑戰(zhàn)性。在適應(yīng)這種惡劣環(huán)境的過程中，上皮細胞已經(jīng)開發(fā)出一種克隆策略來取代去角質(zhì)的細胞。該策略有助于導(dǎo)致異位失調(diào)、腫瘤發(fā)生和蛋白表達譜差異。

????????研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)載體家族22成員12（SLC22A12）是一個組織特異性基因，在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。SLC22A12也被稱為尿酸鹽轉(zhuǎn)運體1（URAT1）或腎臟特異性轉(zhuǎn)運體（RST），是一種位于腎臟近端小管上皮細胞中的膜蛋白。

二、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

1） 數(shù)據(jù)收集自TCGA、cBioPortal for Cancer Genomics、UCSC Xen和ICGC，包括腎臟腎透明細胞癌（KIRC）患者的基因表達數(shù)據(jù)集及臨床信息。

2） ccRCC組織樣本：120對ccRCC及其相鄰的正常腎臟組織；從16對中提取的蛋白質(zhì)通過免疫印跡試驗進行分析；從20對樣本中提取的RNA通過qRT-PCR進行分析；兩對組織通過IHC進行分析；三對組織通過全轉(zhuǎn)錄組測序進行分析

3） 細胞培養(yǎng)：人腎近端腎小管上皮細胞系HK-2，以及從ATCC購買的五種人腎細胞癌細胞系，包括786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1

2.實驗流程

1） 篩選涉及ccRCC細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因：細胞平衡的基因集從GO下載；腎臟特異性基因組從人類蛋白質(zhì)圖譜中收集；差異表達基因集由 "limma "軟件包獲得；SLC22A12的泛癌譜是由GEPIA收集

2） 免疫印跡試驗（IBT）、RNA提取和qRT-PCR、免疫組織化學(xué)（IHC）檢測

3） 細胞實驗：瞬時轉(zhuǎn)染過度表達和敲除SLC22A12、菌落形成試驗、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）試驗、細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8）試驗、細胞遷移和侵襲試驗

4） 生物信息學(xué)分析：SLC22A12表達的中位數(shù)被設(shè)定為將患者分為高表達和低表達組的分界點；GSEA

三、實驗結(jié)果

01 - SLC22A12是一個重要的腎臟特異性腫瘤抑制基因，維持細胞穩(wěn)態(tài)

????????這項工作的目的之一是確定ccRCC的細胞平衡的關(guān)鍵基因，作者篩選了三個獨立的基因組。TCGA數(shù)據(jù)集中的DEGs，腎臟特異性基因集，以及細胞穩(wěn)態(tài)基因集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有19個基因?qū)儆谶@三個基因集（圖1A）。接下來，進行了單變量的Cox回歸分析，以探索基因表達水平與患者生存率之間的關(guān)系。如圖1B、C所示，在所有19個基因中，只有SLC22A12、PTH1R、MT1G和SLC34A1的表達對總生存率（OS）和無病生存率（DFS）有明顯影響。多變量Cox分析（圖1D-K）和臨床病理數(shù)據(jù)證實，SLC22A12是OS和DFS的獨立風(fēng)險因素，具有更好的預(yù)后價值。除了兩個肉瘤樣本（SARC），沒有其他癌癥轉(zhuǎn)錄組資料包括SLC22A12（圖2A，B）。除此之外，SLC22A12只在腎臟中表達（KIRC：腎臟透明細胞癌；KIRP：腎臟乳頭狀細胞癌；KICH：腎臟染色體）。從上述結(jié)果來看，SLC22A12被選為進一步研究的主要基因。

圖1 篩選出參與ccRCC細胞平衡的關(guān)鍵基因

02 - SLC22A12下調(diào)與ccRCC的各種類型的臨床病理特征有關(guān)

????????從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了ccRCC組織和癌旁組織中SLC22A12 mRNA表達水平的數(shù)據(jù)，以了解SLC22A12表達在腫瘤發(fā)生中的作用。結(jié)果表明，SLC22A12在腫瘤組織中的表達明顯低于癌旁組織（圖2C，D），在ICGC數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。此外，作者研究了SLC22A12表達與臨床病理特征之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)該基因表達的降低與原發(fā)腫瘤（T期）、區(qū)域淋巴結(jié)（N期）、遠處轉(zhuǎn)移（M期）、組織學(xué)分級（G期）和AJCC預(yù)后階段的增加有關(guān)（圖2F-M）。另外，女性的SLC22A12表達量較低（圖2E）。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中腎癌SLC22A12的轉(zhuǎn)錄組概況

????????應(yīng)用K-M生存分析和對數(shù)秩檢驗來確定患者的生存與SLC22A12表達之間的關(guān)系。從TCGA數(shù)據(jù)庫中，以SLC22A12 mRNA表達中位數(shù)為分界標(biāo)準(zhǔn)，將522名ccRCC患者分為兩組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLC22A12表達量較低的一組，其OS和DFS最差（圖3A，B），ICGC-RECA隊列的生存數(shù)據(jù)顯示了類似的結(jié)果模式。關(guān)于SLC22A12在具有不同臨床病理特征的ccRCC患者中表達的K-M生存分析與之前的結(jié)果一致（圖3C-Q）。結(jié)果表明，SLC22A12在ccRCC中可能有預(yù)后價值，因為它的表達減少會導(dǎo)致患者的預(yù)后不佳。

圖3 SLC22A12 mRNA的低表達與ccRCC患者的不良OS和DFS有關(guān)

????????為了探索SLC22A12在ccRCC中的診斷價值，作者繪制了ROC曲線來評估患者的臨床病理特征。一般來說，利用SLC22A12的表達水平可以將ccRCC與正常組織適當(dāng)區(qū)分開來，TCGA-KIRC隊列的AUC為0.7258（圖4A），ICGC-RECA隊列為0.8926。此外，SLC22A12表達水平的診斷價值在臨床病理亞組之間進行了分析：男性對女性（圖4B）；T1+T2對T3+T4階段（圖4C）；N0對 N1期（圖4D）；M0期與M1期（圖4E）；AJCC I+II期與III+IV期（圖4F）；G1+G2與G3+G4（圖4G）。結(jié)論是，SLC22A12可能是透明細胞腎細胞癌的潛在診斷生物標(biāo)志物。

圖4 SLC22A12的表達可能是ccRCC患者的一個診斷預(yù)測因素

03 - SLC22A12在ccRCC細胞和組織中下調(diào)

????????作者進行了qRT-PCR和IBT來驗證SLC22A12在RCC細胞中的表達水平。與正常細胞系HK-2相比，SLC22A12在RCC細胞系（786-O、ACHN、A-498、OSRC-2和Caki-1）中的mRNA和蛋白表達水平下降（圖5D，E）。相比之下，SLC22A12在ccRCC組織中的表達水平明顯高于其相應(yīng)的鄰近正常組織（圖5A-C）。RNA-Seq隊列也表明SLC22A12在腫瘤組織中下調(diào)（圖5F）。此外，來自癌癥/副癌癥的IHC結(jié)果表明（圖5G），SLC22A12主要位于癌癥和正常腎小管上皮細胞的質(zhì)膜上；然而，它在癌癥細胞中被下調(diào)。一般來說，這些結(jié)果共同表明，SLC22A12在腎癌細胞中表達不足。

圖5 與相應(yīng)的對照組相比，SLC22A12在RCC細胞和組織中呈下調(diào)趨勢

04 - SLC22A12限制了體外RCC細胞的增殖、侵襲和遷移

????????用SLC22A12質(zhì)粒或si-SLC22A12轉(zhuǎn)染RCC細胞系，研究SLC22A12對腎癌病理的功能。與相應(yīng)的陰性對照相比，ACHN和786-O細胞的mRNA和蛋白表達水平明顯增加或減少（圖6A-C）。在這兩個細胞系中，通過菌落形成（圖6D）、EdU（圖6E，F(xiàn)）和CCK-8檢測（圖6G）分析了細胞活力，作者觀察到SLC22A12沉默促進了細胞增殖。此外，轉(zhuǎn)孔實驗驗證了SLC22A12的表達水平與細胞的遷移和侵入能力呈負相關(guān)（圖6H）。總之，這些結(jié)果提供了堅實的證據(jù)，表明SLC22A12抑制了RCC細胞的增殖、遷移和侵襲，而這些在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。

圖6 SLC22A12在體外促進RCC細胞的增殖、遷移和侵襲

05 - SLC22A12參與了調(diào)節(jié)細胞平衡和ccRCC發(fā)病機制的多種生物途徑

????????利用TCGA-KIRC隊列進行多種功能富集分析，研究SLC22A12在ccRCC發(fā)病機制中的作用。如圖7A-C所示，激活的基因集與多個代謝途徑（圖7A）、細胞周期（圖7B）和腫瘤相關(guān)的信號通路（圖7C）有關(guān)。代謝途徑的富集，包括甘油脂、脂肪酸、葡萄糖，氨基酸和衍生物，和類固醇，表明SLC22A12對代謝物運輸?shù)淖饔靡部赡懿糠终{(diào)節(jié)代謝過程。腫瘤相關(guān)途徑的富集，包括Akt途徑，Wnt途徑，p53途徑，mTOR信號途徑，MAPK途徑，Hedgehog信號途徑和ERKs途徑，表明異常表達的SLC22A12可能激活各種癌癥途徑，促進ccRCC的發(fā)生或發(fā)展。通過IBT驗證了SLC22A12下調(diào)細胞中PI3K和Akt途徑的激活。GO和KEGG分析表明，SLC22A12參與了多種有機化合物、離子和激素的運輸，以及細胞外結(jié)構(gòu)的組織（圖7D，E）。

圖7 SLC22A12在ccRCC中的功能富集分析

????????為了進一步研究SLC22A12如何影響細胞平衡，作者用String數(shù)據(jù)庫進行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并選擇了20個具有最高可信度的蛋白質(zhì)。如圖S3所示，大多數(shù)的蛋白質(zhì)都與平衡狀態(tài)的維持有關(guān)。例如，SLC2A5和SLC2A9參與葡萄糖和果糖運輸；SLC38A3運輸氨基酸，而SLC5A8和SLC16A9運輸各種單羧酸鹽。另外，許多對物質(zhì)交換至關(guān)重要的離子泵也與SLC22A12有關(guān)。此外，大多數(shù)基因在腫瘤組織中的表達與正常組織不同，表明ccRCC的細胞平衡狀況完全不同（圖S4）。總之，SLC22A12可能與這些調(diào)節(jié)腫瘤細胞平衡的蛋白相互作用，從而影響細胞的增殖、侵襲和遷移。

圖S3 與SLC22A12相關(guān)的基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖S4? TCGA-KIRC 隊列中基于 PPI 網(wǎng)絡(luò)的 SLC22A12 相關(guān)基因的熱圖?

四、結(jié)論

????????這是第一個證明SLC22A12的高表達水平與ccRCC患者的不良生存率和低臨床病理分期有關(guān)的研究。此外，SLC22A12的高表達水平可能降低RCC細胞在體外的增殖、遷移和侵襲能力。上述結(jié)果表明，SLC22A12是一個重要的腎癌生物標(biāo)志物，也是一個潛在的高度特異性治療目標(biāo)。SLC22A12的下調(diào)可能影響細胞的平衡，改變腫瘤細胞的生存。