ChIPseeker包南方醫科大學Y叔大牛寫的許多有名的生信R包之一，其最初設計用于chip-seq的macs peak calling結果分析以及可視化，后來逐漸也適用于相關的peak分析。
參考鏈接：https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChIPseeker/inst/doc/ChIPseeker.html；
以及Y叔自己的微信公眾號教程：https://mp.weixin.qq.com/mp/appmsgalbum?__biz=MzI5NjUyNzkxMg==&action=getalbum&album_id=1300625300497268737&scene=173&from_msgid=2247488238&from_itemidx=1&count=3#wechat_redirect
1、關于ChIP-seq
- 之前在學習macs文章時，有了解過；這里再簡單學習一下。
- 如下圖，DNA上的蛋白結合位點往往是基因表達調控的關鍵位置，ChIP技術就是針對性的挑選出這些位置。
- DNA和蛋白質交聯(cross-linking)，超聲(sonication)將染色體隨機切割，利用抗原抗體的特異性識別(IP)，把目標蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，反交聯釋放DNA片段，最后是測序(sequencing)。
-
MACS軟件通過一定原理算法，對測序比對結果識別出有意義的peak。ChIPseeker包就是銜接這一步之后開始做的。
ChIP
2、準備工作 preparation
library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
txdb <- TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene
- 安裝R包，找到示例數據
BiocManager::install("ChIPseeker")
library(ChIPseeker)
files <- getSampleFiles()
print(files)
#bed轉為Granges對象
peak <- readPeakFile(files[[4]])
peak
-
如下圖，即為ChIPseeker包分析所需的peak GRange對象。
分割線左邊三列分別為所在染色體信息，起止位點，正負鏈情況；
右邊兩列分別為peak name與score（我認為可以理解與reads數正相關）
peak
3、ChIPseeker基礎peak可視化
3.1、概況covplot()
觀察所有peak在染色體的分布、表達情況
#依據第五列score，表明峰的高低情況
covplot(peak, weightCol="V5")
#篩選指定染色體的指定區域的分布情況
covplot(peak, weightCol="V5", chrs=c("chr17", "chr18"), xlim=c(4.5e7, 5e7))
3.2、針對某一feature的分布情況
- heatmap
常見的分析是觀察不同peak分布在TSS的promoter區域情況
#自己定義promoter區域，上下游3000bp
promoter <- getPromoters(TxDb=txdb, upstream=3000, downstream=3000)
#不理解這個函數也沒關系，是為下一步做熱圖提供matrix
tagMatrix <- getTagMatrix(peak, windows=promoter)
tagHeatmap(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), color="red")
如下圖結果，每一行代表一個promoter區域，紅線的即為peak分布
#一鍵繪圖，效果同上
peakHeatmap(peak, TxDb=txdb, upstream=3000, downstream=3000, color="red")
- 峰圖
上面的熱圖是描繪了所有的promoter情況，可以繪制一個峰圖描述所有分布的平均情況。
plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000),
xlab="Genomic Region (5'->3')", ylab = "Read Count Frequency")
#加一個置信區間
plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), conf = 0.95, resample = 1000)
we developed getBioRegion function to support centering all peaks to the start region of Exon/Intron. Users can also create heatmap or average profile of ChIP peaks binding to these regions.
4、ChIPseeker peak annotation
4.1 what's peak annotation
-
簡單理解peak 注釋就是peak落在染色體的哪一個位置上。常見的基因結構組成如下圖所示。
basic structure of gene - 此外ChIPseeker的peak注釋時還提供另外一種注釋方法，具體在注釋結果時再具體了解（nearest gene annotation）。
4.2 annotatePeak()
（1）just do it
- ChIPseeker包主要用
annotatePeak()注釋peak。需要提供兩個文件：一是peak文件，可以是bed或者Granges；另一個是對應物種的TxDb對象（提供原始注釋信息） - 此外promoter的區間可以自己定義，默認設置為TSS上下游3k區域
peak
#共計1331個peak
txdb
peakAnno <- annotatePeak(files[[4]], tssRegion=c(-3000, 3000), TxDb=txdb)
peakAnno
如下圖，如果在R里直接觀察結果，它會告訴我們ChIPseq的位點落在基因組上什么樣的區域，分布情況如何。（即第一種注釋方法genomic annotation）
在注釋時，有的peak可能同時落在兩個或者更多的gene feature里（例如是一個基因的外顯子而同時又是另一個基因的內含子），但只能注釋其中一個。默認按照Promoter、5’ UTR、3’ UTR、Exon、Intron、Downstream、Intergenic順序先后注釋。
- 一般會將上述的結果輸出為GRanges格式、或者data.frame格式；便于查看，同時也能了解到
annotatePeak第二種nearest gene annotation結果。
class(peakAnno)
peakAnno.df <- as.data.frame(peakAnno)
peakAnno.gr <- as.GRanges(peakAnno)
head(peakAnno.gr, 3)
如下圖，右上角為genomic annotation結果、下面為nearest gene annotation結果。
- nearest gene annotation最近基因注釋：是peak相對于轉錄起始位點的距離，不管這個peak是落在內含子或者別的什么位置上，即使它落在基因間區上，我都能夠找到一個離它最近的基因（即使它可能非常遠）。
- 如果peak和TSS有overlap，genomic annotation就是promoter，距離就是0，而最近基因也是同一個，所以在這種情況下，兩種注釋都指向同一個基因。
-
最近基因的注釋信息雖然是以基因為單位給出，但我們針對的是轉錄起始位點來計算距離，針對于不同的轉錄本，一個基因可能有多個轉錄起始位點，所以注釋是在轉錄本的水平上進行的，我們可以看到輸出有一列是transcriptId.
head(peakAnno.gr, 3)
另外一種思路：注意上述nearest gene annotation默認找的是最近的TSS，即first anno與second anno對應的可以不是同一個基因。如果我想說只要和基因有overlap就是最近基因，那么這兩種注釋的基因應該是一致的，只需把
overlap="TSS"(default)設置為overlap="all"
5、ChIPseeker基于注釋的peak可視化
（1）genomic annotation可視化
- 餅圖或柱狀圖可視化組成比例
plotAnnoPie(peakAnno)
plotAnnoBar(peakAnno)
- 考慮到注釋到多種feature的可能
vennpie(peakAnno)
upsetplot(peakAnno, vennpie=TRUE)
如下圖可以清楚地看到絕大多數的peak同時落到了多種feature里
（2）nearest gene annotation結果可視化
- 可視化the distance from the peak (binding site) to the TSS of the nearest gene
-
plotDistToTSScan calculate the percentage of binding sites upstream and downstream from the TSS of the nearest genes, and visualize the distribution.
plotDistToTSS(peakAnno,
title="Distribution of transcription factor-binding loci\nrelative to TSS")
ChIPseeker包暫時先學習到這里，還有很多深入的功能，比如富集分析等，之后有機會再學習。
感覺到國人寫的R包，然后看中文的原版說明書還是比較輕松的~~
