一、研究背景

1、乳腺癌的研究現狀

近年來乳腺癌發病率已位居女性所有癌癥類型中的第一位，其致死率居第二位，僅次于肺癌。目前對于乳腺癌具有多種治療手段，如手術、放化療、分子靶向治療、內分泌治療及免疫治療等，這些方法較為明顯的提高了早期乳腺癌患者的治愈率，雖然針對乳腺癌分子靶向治療領域做了較多的研究，但作為一種亞型，乳腺癌干細胞(BCSCs)在乳腺癌的侵襲性、化療耐藥和腫瘤復發中起著重要作用，但其具體的分子機制研究尚不完全明確。

2、腫瘤細胞衍生的細胞外小泡（EVs）可以將分子轉移到鄰近細胞，以發揮致癌特性，這將是腫瘤治療的新靶點

在此背景下，相關研究發現，BCSCs衍生的EV(BCSCs-EV)通過遞送miR-197促進BC細胞的轉移潛能。EVs介導的長非編碼RNA（lncRNA）的遞送影響受體細胞的生物學特性，這正成為包括乳腺癌在內的致癌作用的一種新的機制。有報道稱，BC細胞的富含lncRNA snhg16的EV可引起BC細胞上皮-間質轉化(EMT)、遷移和侵襲能力的顯著升高。而ARRDC1-AS1已被報道在腦膠質瘤B的進展中發揮促瘤作用，ARRDC1-AS1在BC中表達上調，可作為這種惡性疾病的預后指標。另外AKT1抑制通過egfr介導的β-catenin核積累增強了BC的轉移潛能。

二、解決的科學問題

1、ARRDC1-AS1已被報道在BC中表達上調，并可作為這種惡性疾病的預后指標，那ARRDC1-AS1在BC進展的關鍵節點如：BC細胞及BCSCs-EV，中的表達情況是怎樣的？?

2、如果ARRDC1-AS1在BC的進展過程相關，那ARRDC1-AS1在BC的進展中發揮怎樣的作用呢（促瘤or抑瘤）？

3、LncRNAs主要調控細胞中轉錄水平和轉錄后水平的基因表達，從而影響腫瘤的生長。在轉錄后水平，lncRNAs通過與miRNA靶向的3’-UTR競爭性結合，將miRNA隔離釋放靶基因的表達，或衍生成熟的miRNA間接調控靶基因的表達，從而發揮功能。那ARRDC1-AS1是否也通過miRNAs影響腫瘤的進展呢？

4、經過實驗我們得知miR-4731-5p可通過miRNA種子序列(5'UTR處2-8 nt)與靶mRNA 3'UTR之間的互補作用靶向mRNA，直接抑制翻譯，或引起mRNA不穩定，從而降解靶蛋白。那miR-4731-5p又是否通過調控靶基因參與BC惡性進展

5、通過實驗我們明確了ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的下游靶點，并形成了ceRNA調控，即ARRDC1-AS1/miR-4731-5p/AKT1，那么BCSCs-EV是否通過調控ceRNA網絡影響BC細胞的惡性生物學行為呢？

6、bcscs - ev是否能夠傳遞ARRDC1-AS1影響，進而影響裸鼠體內BC細胞的生長？

三、目的和意義

在本研究明確了乳腺癌干細胞源性細胞外囊泡(BCSCs-EV)在BC中傳遞ARRDC1-AS1的致癌機制，ARRDC1-AS1促腫瘤作用的發現為BC的機制提供了新的見解，有助于臨床進一步研發以ARRDC1-AS作為靶點治療BC的手段。

四、研究內容和結果

1、ARRDC1-AS1在BC細胞和BCSCs-EVS中高表達

A.檢索exoRBase數據庫，在BC患者的血源性EVs中獲得了92個上調的lncrna(≥2倍)。

B .bcsc相關數據集GSE151191的差異分析鑒定出55個上調的lncrna(≥10倍)。

C.對來自exoRBase數據庫和GSE151191數據集的lncrna進行交叉分析，發現了兩個候選lncrna (HOTAIRM1和ARRDC1-AS1)。

D.只有ARRDC1- AS1在TCGA數據庫的BC樣本中較正常樣本顯著高表達(p < 0.001;)。

E.在exoRBase數據庫中，ARRDC1-AS1在BC患者血源性EVs中的表達也增加(p < 0.01)。

F.為了進一步驗證，RT-qPCR檢測了人正常乳腺上皮細胞MCF-10A和BC細胞MCF-7、MDA-MB-MB-453和SK-BR-3中ARRDC1-AS1的表達。結果顯示，ARRDC1-AS1在BC細胞中的表達高于MCF-10A細胞，其中MCF-7細胞中ARRDC1-AS1的表達最高。

2、沉默BCSCs中ARRDC1-AS1抑制BC細胞的惡性表型。

A.選擇ARRDC1-AS1表達最高的MCF-7細胞用于流式細胞儀的細胞分選。相應地獲得了BCSC CD44+?CD24-亞群。

B、C.從BCSCs中提取EVS，并用透射電子顯微鏡和NTA進行鑒定。大多數EV是直徑約100 nm的脂雙層包裹的囊泡。

D.Western印跡分析顯示EVS標記CD63、TSG101和CD81為陽性，而非EVS標記如Calnexin為陰性。（這些結果表明成功地提取了BCSCs-EVS）。

[if !supportLists]E.?[endif]免疫熒光顯微鏡下觀察BC細胞攝取BCSCs-EVS的情況，結果顯示大量BCSCs-EVS進入BC細胞并分布在細胞核周圍,這一結果確保了EVS攜帶的RNA也進入細胞發揮相應的生物學功能。

F通過RT-qPCR驗證了針對ARRDC1-AS1的沉默效果最好的sh-ARRDC1-AS1-1，經sh-ARRDC1-AS1處理的BCSCs和BCSCs-EVS中ARRDC1-AS1的表達都降低。

G.RT-qPCR結果顯示，與EVS或EVS-sh-NC共培養的BC細胞中ARRDC1-AS1的表達比對照BC細胞高2倍以上，而與EVssh-ARRDC1-AS1共培養的BC細胞中ARRDC1-AS1的表達水平與對照細胞相近。

H，I，K，L.此外，CCK-8試驗、Transwell試驗和流式細胞儀檢測顯示，EVS或EVS-sh-NC與BC細胞共培養時，BC細胞的增殖、遷移和侵襲均被促進，細胞凋亡率被抑制(相對于對照組>60%)，而EVS-sh-ARRDC1AS1可取消這些作用。

J.谷氨酸水平與腫瘤侵襲能力的變化密切相關,谷氨酸檢測試劑盒檢測BC細胞培養液中谷氨酸的濃度。結果表明，與EVS(51%)或EVS-sh-NC(45%)共培養的BC細胞培養液中谷氨酸濃度比對照細胞升高，而沉默ARRDC1-AS1使其濃度比與EVS-sh-NC共培養時降低25%.

3、ARRDC1-AS1與BC細胞中miR-4731-5p的競爭性結合

A、基于從GEO數據庫獲得的BC相關miRNA數據集GSE57897進行了miRNA的差異表達分析。結果產生了53個顯著下調的miRNAs(≥10倍)。

B、ENCORI數據庫預測了可能與ARRDC1-AS1結合的miRNAs，然后與從GSE57897數據集中獲得的顯著下調的miRNAs相交，只產生一個候選miRNA，即miR-4731-5p。

C、RIP試驗與RT-qPCR相結合表明，ARRDC1-AS1的濃縮水平顯著提高了3.8倍，證實了與ARRDC1-AS1結合的miRNAs的存在。

D、Bio-miR-4731-5P-WT組的ARRDC1-AS1濃縮水平是生物探針-NC組和Bio-miR-4731-5P-MUT組的3倍。

E、FISH數據顯示，ARRDC1-AS1和miR-4731-5p共同定位于BC細胞。

F、Starbase數據庫預測到ARRDC1-AS1和miR-4731-5P的結合位點的存在，然后使用定點突變獲得ARRDC1-AS1-MUT。

G、進一步的雙熒光素酶報告基因分析表明，miR-4731-5p模擬物降低了ARRDC1-AS1-WT的熒光素酶活性，但不影響ARRDC1-AS1-MUT的熒光素酶活性。（這些結果表明，ARRDC1-AS1可以作為miR-4731-5P與AGO2結合的平臺）。

H、I檢測ARRDC1-AS1表達變化對miR-4731-5p的影響。

G、RT-qPCR驗證了ARRDC1-AS1的過表達或沉默效率(均>2倍)。

K、RT-qPCR結果顯示，sh-ARRDC1-AS1處理的BC細胞miR-4731-5p的表達比sh-NC處理的細胞增加，而OE-ARRDC1-AS1處理的BC細胞miR-4731-5p的表達比OE-NC處理的細胞減少

4、miR-4731-5P靶向并抑制BC細胞AKT1

A、對BC相關基因數據集GSE80754進行了差異分析，獲得了845個顯著上調的基因(≥10倍)

B、通過ENCORI和TargetScan數據庫預測miR-4731-5p的靶基因，它們與GSE80754數據庫中顯著下調的基因相交。獲得了110個候選靶基因

C、蛋白質-蛋白質相互作用分析表明，AKT1是相互作用網絡中的核心蛋白質

D E、基于miR-4731-5P與AKT1 3‘UTR的結合部位，以及雙熒光素酶報告基因分析，進一步證實了miR-4731-1-5P模擬物抑制了AKT1-WT的熒光素酶活性。

F、ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的同時增加降低了總AKT1蛋白水平和AKT1磷酸化程度，與對照組接近。（因此，AKT1是miR-4731-5p的靶基因）。

5、BCSCs-EVS可以調節ARRDC1-AS1/miR-4731-5p/AKT1，促進BC細胞的惡性表型。

A B.經sh-NC+EVS聯合培養的BC細胞，ARRDC1-AS1和AKT1的表達增加(2.5倍)，miR-4731-5p的表達降低(62%)，而經sh-AKT1處理后，AKT1的表達降低，而對ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的表達無影響。在sh-AKT1+EVS存在下，ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的表達在BC細胞中沒有顯著差異，AKT1的表達低于sh-NC+EVS處理。（以上結果提示，EVS攜帶的ARRDC1-AS1在一定程度上通過抑制miR-4731-5而拮抗AKT1的沉默作用）

C D F G.根據CCK-8試驗、Transwell試驗和流式細胞儀的結果，與sh-NC共培養相比，sh-NC+EVS可促進BC細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，而這些作用可被sh-AKT1取消；但sh-AKT1+EVS減弱了sh-AKT1對BC細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，以及對細胞凋亡的促進作用。

E.與Sh-NC+EVS共培養后，BC細胞培養液中谷氨酸濃度較與Sh-NC共培養時升高，而AKT1的沉默降低了谷氨酸濃度。EVS和sh-AKT1聯合處理導致谷氨酸濃度比sh-AKT1處理增加1.9倍。

6、BCSCs-EVS通過攜帶ARRDC1-AS1促進裸鼠BC細胞的成瘤

A.建立BC裸鼠模型，分別注射EVS、EVS-sh-NC或EVS-sh-ARRDC1-AS1。結果發現，與對照組相比，注射EVS的小鼠腫瘤組織中ARRDC1-AS1和AKT1的表達增加了2倍，而miR-4731-5p的表達降低了76%。

B.與注射EVS-sh-NC相比，注射EVssh-ARRDC1-AS1將ARRDC1-AS1和AKT1的表達降低到與對照組小鼠相似的水平，并上調了小鼠腫瘤組織中miR-4731-5p的表達。

C E.注射EVS的小鼠的腫瘤體積和重量比對照組增加；EVS-sh-ARRDC1-AS1治療與EVS-sh-NC治療的結果相反。

F G. EVS-sh-ARRDC1-AS1導致了與EVS-sh-NC處理相反的結果(Ki67陽性細胞減少33%，TUNEL陽性細胞增加2.8倍)

五、總結

含有ARRDC1-AS1的BCSCs-EV通過與miR-4731-5p競爭結合上調AKT1的表達，從而促進BC細胞的惡性進展。

六、優缺點

1、具有重要臨床意義：有助于臨床進一步研發以ARRDC1-AS作為靶點治療BC的手段。

2、可參考作者既新穎又嚴謹實驗設計思路：通過其他腫瘤模型，尋找BC的潛在治療靶點，利用lncRNAs與miRNA之間的關系，尋找到新靶點的下游因子，并通過生物學分析等多種實驗方法來驗證，進而探究出乳腺癌干細胞源性細胞外囊泡(bcscs - ev)在BC中傳遞ARRDC1-AS1的致癌機制。

3、可參考作者的方法學：生信分析尋找可靠的下游靶點、cck-8檢測細胞活力、Transwell探究腫瘤細胞遷移、流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡情況、免疫組化染色法、采用熒光原位雜交(FISH)測定經EVs與BC細胞共培養后是否成功提取BCSCs-EVS等多種實驗方法。