本期向大家介紹一篇在Molecular Cancer最新發布的關于三陰性乳腺癌中CircNR3C2通過海綿化miR-513a-3p促進HRD1介導的腫瘤抑制作用，文章題目：CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR513a-3p in triple-negative breast cancer，原文地址：10.1186/s12943-021-01321-x，影響因子：15.302，作者：蘇東明教授（南京醫科大學附屬逸夫醫院）。

乳腺癌常被稱為“粉紅殺手”，其發病率位居女性惡性腫瘤的首位，男性乳腺癌較為少見。乳腺癌根據基因表達模型不同主要分為四個不同的分子亞型，其中三陰性亞型乳腺癌被報道最多的一種亞型。原發性腫瘤的轉移和復發是導致死亡的主要原因，上皮間充質細胞轉移是乳腺癌擴散過程中的一個重要環節，在擴散的過程中，波形蛋白的表達顯著升高，表明了波形蛋白在癌細胞轉移過程中起到重要的作用，其中翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化以及泛素化都會影響波形蛋白結構和功能的穩定性。最新研究報道稱E3泛素連接酶TRIM56和RNF208通過誘導波形蛋白的多泛素化介導蛋白酶體降解，分別減少卵巢癌和乳腺癌細胞的遷移和侵襲。本文作者也發現了一種E3泛素連接酶HRD1通過相關作用來減少乳腺癌細胞的遷移和侵襲，作者通過本文闡述E3泛素連接酶HRD1如何通過相關作用機制來對腫瘤的抑制作用。

結果展示

??HRD1在三陰性乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中顯著低表達

作者為了探討HRD1在不同乳腺癌亞型中的表達模式，用一些臨床樣本組織和相關癌細胞，運用了Immunoblotting、immunohistochemical staining 和 RT-qPCR研究方法，結果表明：相對于乳腺癌其他三種亞型組織樣本和細胞樣本，HRD1在三陰性乳腺癌中的表達水平顯著低于其他幾種亞型乳腺癌（如圖下圖A-I），初步說明了HRD1在三陰性乳腺癌中起到至關重要的蛋白分子。

??HRD1表達與波形蛋白（Vimentin）表達負相關

相關報道HRD1是一種E3泛素連接酶，以及一種在乳腺癌中起到至關重要的蛋白分子- Vimentin，作者為了研究HRD1的功能以及和Vimentin之間的作用機制，構建了過表達HRD1載體，瞬轉到MDA-MB-231乳腺癌細胞系中，結果發現，過表達HRD1組中，Vimentin的蛋白表達水平顯著降低于對照組。作者還通過收集60例臨床組織樣本，通過免疫組化觀察兩種蛋白分子的表達情況，結果表明兩種蛋白的表達水平呈負相關（如下圖A-F）。

??波形蛋白的降解需要HRD1泛素化作用

根據結果2，作者大膽猜測HRD1可能通過泛素化機制對波形蛋白起到降解作用。為了證實這種猜測，選MDA-MB-231和BT549兩種細胞，過表達HRD1，免疫印跡分析結果表明，波形蛋白在兩種細胞中的表達水平顯著減少，同時也觀察細胞中其他的上皮細胞-間充質轉化標記蛋白的表達量沒有發生變化。用環己酰亞胺處理細胞后進行WB，結果表明HRD1主要是通過蛋白酶對波形蛋白起到快速降解作用。作者還通過免疫共沉淀、免疫熒光染色以及Co-IP試驗方法證實了HRD1和波形蛋白存在著相互結合作用。此外，基于泛素化發生在目標蛋白的賴氨酸殘基這個事實，作者在波形蛋白的頭部結構域中鑒定出一個賴氨酸殘基，為了檢查該殘基對HRD1介導的波形蛋白的泛素化是否至關重要，通過用丙氨酸替代在不同物種中進化保守的賴氨酸殘基生成波形蛋白突變體，當野生型波形蛋白通過HRD1進行多泛素化時，波形蛋白突變體并沒有進行多泛素化（如下圖A-K）。

??HRD1通過對波形蛋白降解起到抑制腫瘤形成和上皮介質轉化

作者繼續探討HRD1通過對波形蛋白降解起到抑制腫瘤形成的機制。作者通過CCK8和單克隆形成實驗證實過表達HRD1能夠抑制細胞增殖和分化，相反同時過表達波形蛋白能挽救這種現象。作者還進行了在相關三陰性乳腺癌中過表達HRD1，細胞的遷移能力和侵襲能力都顯著減弱，劃痕實驗也驗證了細胞的侵入能力顯著下降（如下圖A-K）。

??CircNR3C2和miR-513a-3p被預測起到調控HRD1的作用

作者為了找到和HRD1相關的circRNA和miRNA分子，在GEO數據庫上下載關于乳腺癌的臨床信息，應用生物信息學手段找到和HRD1相關TOP 10的circRNA，作者接下來通過GO和KEGG的富集分析，也找到了和HRD1作用相關的miRNA，最后通過在線網址預測能相互作用的circRNA和miRNA，確定了circNR3C2和miR-513a-3p作為后續研究分子（如下圖A-I）。

??CircNR3C2在三陰性乳腺癌顯著下調

CircNR3C2核酸序列全長1760bp，由基因NR3C2第二個外顯子剪接而形成。分別提取三陰性乳腺癌組織樣和其他亞型乳腺癌組織樣RNA，QPCR結果表明：相對于其他亞型乳腺癌組，CircNR3C2和HRD1在三陰性乳腺癌組織中的mRNA表達水平顯著降低。通過FISH實驗證實了CircNR3C2存在細胞質中（如下圖A-H）。

??過表達circNR3C2通過海綿吸附miR-513a-3p促進HRD1上調

通過生物信息學分析結果可知circNR3C2和miR-513a-3p相互作用能調控HRD1在乳腺癌中的表達。通過在MDA-MB-231細胞瞬轉miR-513a-3p mimic或者inhibitor，應用免疫印跡和RT-PCR方法檢測細胞中HRD1蛋白和mRNA表達水平顯著減少（mimic）或者增多（inhibitor）。作者為了驗證miR-513a-3p和HRD1的作用關系，設計了與miR-513a-3p結合位點突變的HRD1序列和正常結合位點序列分別進行熒光素酶報告實驗，結果顯示，轉染miR-513a-3p mimic或者inhibitor可以顯著減少或者增加熒光強度。同時，過表達circNR3C2同樣能增加HRD1的mRNA表達水平或者蛋白表達水平但是不能顯著減少miR-513a-3p的mRNA水平。作者通過RNA pull down實驗證實了circNR3C2和miR-513a-3p相互結合位點，同樣設計了突變型和野生型circNR3C2雙熒光素酶質粒進行熒光素酶報告實驗，結果表明miR-513a-3p inhibitor能顯著減少熒光強度。所以通過以上的一系列結果說明circNR3C2、miR-513a-3p和HRD1的相互關系能夠影響乳腺癌的發生。

??通過過表達circNR3C2引起波形蛋白的降解從而抑制腫瘤的生長和轉移

根據以上的結果，作者猜測過表達circNR3C2能夠影響波形蛋白在三陰性乳腺癌細胞的穩定性。通過在三陰性乳腺癌細胞中過表達circNR3C2，觀察波形蛋白的mRNA表達水平和蛋白表達水平，結果表明，相對于對照組過表達circNR3C2能夠促進波形蛋白的翻譯水平提高，而mRNA表達水平沒有明顯變化。在細胞功能驗證中，作者通過CCK8和克隆形成實驗來研究過表達circNR3C2對細胞增殖的影響，以及通過劃痕實驗和侵襲實驗研究過表達circNR3C2對細胞侵襲的影響，結果表明過表達circNR3C2能夠抑制細胞的增殖和侵襲能力降低。最后，作者建立了一個體內腫瘤轉移模型，講用不同處理的MDA-MB-231細胞尾靜脈注射免疫缺陷裸鼠體內，過表達circNR3C2組肺轉移和轉移性肺結節顯著減少（如下圖A-I）。

總結

本文作者闡明了一種新的腫瘤抑制因子HGD1通過誘導多泛素化介導波形蛋白的蛋白酶體降解，作用機制主要是通過circNR3C2海綿吸附miR-513a-3p促進HRD1上調，從而起到對波形蛋白的蛋白酶體降解作用，最終抑制三陰性乳腺癌的增殖和轉移。