共病遺傳（或稱異病同根），我們對疾病的認識從回溯至遺傳學根源的那一刻起就已經進入了另一個新的里程。
今天我想分享一篇今年9月24日發表于 《Nature communication》上一篇名為“Investigating the shared genetic architecture between multiple sclerosis and inflammatory bowel diseases1” 的文章，它的中文名這里翻譯為：關于多發性硬化癥（MS）和炎癥性腸病（IBD）的共同遺傳結構的研究。
文章除了圍繞多發性硬化癥（MS）和炎癥性腸病（IBD）之外，我認為這篇文章更重要的一個方面是闡述關于共病遺傳的研究方法和思路。
我這里說的 “共病遺傳（或稱異病同根）” 指的是表面上看起來不同的疾病，實際上有著一個共同的起源和誘因，這個起源很多時候就來自于相同遺傳結構上的失調所致。
NC 的這篇文章就是通過研究遺傳因素確定了 MS 和 IBD 之間所存在著的共同遺傳結構（Shared genetic architecture）。
它的研究思路主要是利用全基因組關聯分析方法(Genome-wide association study ,GWAS)和孟德爾隨機化方法(Mendelian randomization,MR）。同時在研究中作者也使用了多種較新的統計學方法。 所以，在這篇文章里，我主要是想借由對這篇NC文章的解讀和大家一同了解并學習一下關于異病同根的研究思路和用到的統計學方法。
接下來，文章將從背景、方法和結果這三個方面展開。
背景
首先，我們想象自己是一個臨床醫生：一個同時患有多發性硬化癥（Multiple sclerosis, MS）和炎癥性腸病（Inflammatory bowel diseases, IBD）的患者前來就醫。但不幸的是臨床上常用于治療多發性硬化癥的藥物會加重炎癥性腸病的癥狀，并且臨床上常用于治療炎癥性腸病的藥物又會惡化多發性硬化癥的病程，這個時候你該怎么辦？
- 多發型硬化癥（multiple sclerosis ,MS）：一種影響運動、感覺和認知的中樞神經系統疾病，以炎癥性脫髓鞘和神經退行性病變為主要特點的獨特而罕見的自身免疫病，主要表現為反復發作的視力模糊、四肢無力、疼痛、疲勞等。
- 炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases ,IBD）：一種以胃腸道慢性炎癥為特征的腸道疾病，包括潰瘍性結腸炎(UC，主要發生在大腸和直腸，偶爾在末端回腸)和克羅恩病(CD，可累及腸道所有部位)，主要表現為腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀。
這個設想的病例并非天方夜譚，近年來的流行病學研究確實已經發現了 MS 和 IBD 之間在病因學上是存在關聯的（事實上還有很多疾病都存在類似的關聯）。那么，作為一名臨床醫生要想對這類病人提供合理的治療方案，就有必要深入地研究這兩種疾病背后的共病機制。
在9月24日 Nature communication 上發表的這篇文章里，作者來自澳大利亞塔斯馬尼亞大學孟席斯醫學研究所 MS 研究團隊，他們利用公開的數據集著重研究了 MS 和 IBD****背后潛在的遺傳關聯。
這個研究的數據來源全部是公開數據（我很佩服這一點，可見提出有意義的科學問題是多么的重要），是對現有數據的再次挖掘，原文后附有全部數據集的地址。
MS 和 IBD 都是具有中等遺傳力的疾病，已有的 GWAS 已經報道了上百個與MS、IBD(UC/CD) 發病風險有關聯的突變，并通過富集分析發現了 MS 和 IBDs 有關的 SNPs 位點在相同的組織（如肺，全血）里都有富集。另外，也發現了這兩類疾病共享了幾種風險基因座(loci，染色體上有遺傳效應的DNA序列)。
遺傳力（Heritability）：遺傳因素對性狀的影響大小，定義為遺傳方差占性狀方差的比值，介于 0~1 之間。當遺傳力為1時，表型變異完全由遺傳因素決定，當遺傳力為0時表型變異完全由環境因素決定。一般認為, 大于 30% 的遺傳力叫做高遺力, 10%~30% 為中等遺傳力, 10%以下為低遺傳力。
但是，想要真正深入理解這兩個病的共同遺傳基礎，還需要解決下面這三個問題：
1、與 MS 和 IBD 存在遺傳聯系的 SNPs 主要是是哪些在起作用？
2、MS 和 IBDs 之間是否存在基因多效性（pleiotropy）的影響或者存在內在的因果關系？
3、共享的富集組織/細胞是否反映出了這些細胞類型即是這兩種疾病的共病基礎？
基因的多效性（pleiotropy）：一個基因決定多種表型性狀的性質。例如，人的鐮刀型細胞貧血往往合并黃疸，雖然病因只是由一個突變基因（β鏈的第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替）所致，但在體內，鐮刀狀紅細胞往往會阻塞肝的小血管從而引起黃疸并發。
如何回答這些問題就是這個研究的核心了，同時它的思路和策略是我們要重點關注的地方。
方法與主要結果
圖1 技術路線和統計方法示意圖
圖1是文章的主要技術路線圖，概述如下：
對于第一個問題：首先，利用 MS 和 IBDs 的 GWAS 匯總數據進行 S-LDSC 和雙變量 LDSC 分析，鑒定出了 MS-IBDs 的全基因組遺傳關聯，使用ρ-HESS估計了不同MS-IBDs的局部遺傳關聯；在確認了遺傳關聯后，研究用跨性狀全基因組關聯meta分析識別與MS-IBDs共病的風險SNPs；
對于第二個問題：使用 6 種不同的孟德爾隨機化方法來穩健且全面地評估 MS 和每種 IBDs 之間的因果關系和潛在的基因多效性現象；
對于第三個問題：同時使用 GTEx 和單細胞測序（scRNA-seq）數據，對 MS 和 IBDs 在多種不同組織和多種特異性細胞中的表達分別依據 SNP 類型進行富集分析，從而鑒別出與每種或多種疾病關聯最密切的組織/細胞類型。
孟德爾隨機化(mendelian randomization ,MR)：為了研究某種exposure和result之間的因果關系，研究中可能會用到MR分析，它的基本思想就是將某些遺傳位點作為中間媒介，對與exposure有關的顯著遺傳位點與result進行關聯分析，如果結果是這個遺傳位點和result有統計學意義上的關聯，那么我們認為exposure和result之間存在因果關系；反之，則認為他們不存在因果關系。
這個研究所用到的數據都是公開可得的，原文附有這些數據集的地址，其中：
1、MS 的 GWAS summary 結果來自國際多發型硬化病遺傳學聯合會（IMSGC）里包含15個數據集的 GWAS meta 分析（包括14,802名病例和26,703名對照，病例和對照都是歐洲人），同時數據還用了千人基因組的數據作為 Panel 進行 Imputation，再通過一系列質控，排除模糊SNPs，按MAF>1%的標準，最后得到約 6.8M 的 SNPs 納入 meta 分析；
2、IBD（包括UC和CD兩部分，12,882病例和21,770對照），UC（6,968 病例20,464對照)和 CD （5,956病例14,927對照）的 GWAS 分析數據來自 EBI：按MAF>1%的標準，三種疾病共約 9.5M 的 SNPs 納入 GWAS 分析；使用 PLINK 進行分析，同時將主成分作為協變量校正結果。
3、GTEx（Genotype-Tissue Expression 基因型-組織表達）數據來自 GTEx 數據庫，共有 751 個個體的 53 個組織的數據，平均每個組織類型有 220 個樣本。此外，研究者還下載了 GTEx V7 中控制表達數量性狀基因座(eQTL)匯總數據，用于下游分析。
4、基于 GTEx 富集分析的數據，研究者收集了健康人中 4 個顯示出顯著富集的組織的84種細胞類型的單細胞測序（scRNA-seq）數據（包括肺，57,020個細胞；脾，94,257個細胞；外周血，68,579個細胞；小鼠小腸，7,216個細胞），這些數據也同樣來自既往報道。
最后，他們通過這些數據，得到了如下結果：
鑒定出 MS 與 UC 之間的遺傳相關性顯著高于 MS 與 CD 的遺傳相關性；
鑒定出 MS 和 IBD(或UC或CD) 共有的3個 SNP；
鑒定出一個候選基因 (GPR25) 與 MS 和 IBD(或UC) 的共病易感性顯著相關。
提示了 MS 對 IBD 和 UC 存在因果效應；
肺中的 CD4+T 細胞在所有四種疾病中都有顯著的 SNP 富集；肺和脾臟的 CD8+ 細胞毒性 T 細胞在 MS 和 CD 中顯著富集；小腸末端回腸的腸上皮祖細胞和早期腸上皮祖細胞中 MS 和 UC 顯著富集。
具體方法
接下來是我們關心的具體方法，一共分為七個步驟。
第一步，使用分層連鎖不平衡回歸分析（stratified LD score regression,LDSC，S-LDSC）方法和基線連鎖不平衡模型（baseline-LD model）分別估計 MS 和 IBDs 的關聯 SNP 遺傳力。之后再用雙變量 LDSC 計算 MS 與 IBDs 疾病間的遺傳相關性（rg值），計算的方法就是將這兩性狀之間共享的遺傳方差除以他們各自遺傳力乘積的平方根。
LDSC：連鎖不平衡回歸分析，一種GWAS后處理策略，主要用來評估混雜和計算遺傳力，通過檢測連鎖不平衡和檢驗統計量之間的回歸關系來量化并區別GWAS檢驗統計量的膨脹是由多基因遺傳引起還是由混雜偏差（如人群分層、隱形親緣關系等）引起，回歸得到的截距是比基因組控制（genomic control）更準確的校正因子。 S-LDSC: 按功能注釋進行遺傳力分割的一種新方法，相比以往需要個體基因型的遺傳力h2SNP劃分方法，S-LDSC只需要GWAS匯總數據和與研究人群血統匹配的參考基因組信息即可，可用作富集分析。 baseline-LD model：S-LDSC的擴展。
圖2. MS 與 IBDs（每一種IBD）的遺傳相關性
圖2是所得到的分析結果，Y 軸表示的是經雙變量 LDSC 估計后得到的每一對疾病對之間的 rg估計值。我們可以發現，無論有沒有限制截距，UC-CD 之間的遺傳相關性都是最高的。另外在 MS-IBDs 的遺傳相關性估計中，MS-UC最高，之后是 MS-IBD，最后是MS-CD，這樣的分布是符合預期的，因為 IBD 包括 UC 和 CD 兩部分的病人，所以它的結果就應該是處于中間的。另外，MS-IBD 的協方差截距是 0.1，這意味著他們之間存在輕微的樣本重疊。
第二步，用匯總統計資料的遺傳力估計方法 ρ-HESS (Heritability Estimation from Summary Statistics，HESS) 估計 MS 與各種 IBDs 之間的局部遺傳相關性（因某特定遺傳區域的共享遺傳方差造成的性狀差異，即計算在各局部區域中 “疾病對” 的 rg值)。通過 ρ-HESS 一共分析了1699 個（近似） LD 獨立的區域，區間的平均大小 ~1.5M，而且還包括了主要組織相容性復合體（MHC）的 5 個區域。
結果如圖3 所示，在這個圖中從上到下，分別是 MS-IBD、MS-UC、MS-CD 這三個疾病對，而 Intersection 表示兩病共享遺傳區域的 rg 值，Neither 表示與兩病均無關區域的 rg 值。在結果里可以看到，沒有證據表明存在 MS 特有的區域與 IBDs 特定區域的遺傳相關性存在差異。疾病特有區域（例如 MS-IBD 比較的 MS 特異位點和 IBD 特異位點）的局部遺傳相關性估計值也與通過雙變量 LDSC 的全基因組 rg 估計值基本一致，那么這就意味著 MS 和 IBDs 的遺傳關聯很可能是在整個基因組中共享遺傳變異而不是在特定的基因組區域里的強相關。不過在 MS-UC 和 MS-IBD 的5個 MHC 區域上發現了顯著的局部遺傳相關性，但 MS-CD 沒有，這可能是因為 MHC 區域對 MS-UC/IBD 的貢獻大于MS-CD 所致。
圖3 MS 與 IBDs 局部遺傳相關性
第三步，在已知 MS 和 IBDs 有顯著關聯的基礎上，用跨性狀全基因組關聯（cross-trait meta-analysis of GWAS）分析的方法識別出了與 MS-IBDs 共病發生有關聯的風險 SNPs。文章在這里用到了兩種互補的方法，MTAG（Multi-Trait Analysis of GWAS）和CPASSOC（Cross Phenotype Association），更加保守地優先選擇那些使用兩種方法都超過全基因組顯著性（p<5×10?8）的SNPs。
通過這樣的分析發現了三個SNPs：一個是與 MS-IBD 和 MS-CD 共病都有顯著關聯的 SNP (rs13428812) ，一個是只與 MS-UC 共病有顯著關聯的(rs116555563) 和一個只與MS-CD 有顯著關聯的 SNP (rs9977672)，而這三個 SNP 可能參與了調節 MS 與相應 IBDs 的共有作用通路。
MTAG：一種多性狀全基因組分析方法，相比常規的單性狀GWAS分析，MTAG利用多性狀的GWAS summary statistics進行聯合分析，增強了統計分析的power；相比其他的多性狀全基因組分析方法，具有更廣泛的應用場景。 CPASSOC：一種通過使用來自多個表型的GWAS的匯總統計數據來研究交叉表型(CP)關聯的方法。
第四步，分析 MS 和 IBDs 之間的因果關系。這里一共使用了六種雙向孟德爾隨機化方法，包括基于廣義匯總數據的孟德爾隨機化（Generalised Summary-data-based Mendelian Randomisation，GSMR）， MR-Egger，逆方差加權法（Inverse variance weighting，IVW），加權中位數（Weighted median），加權模式（Weighted mode）和 CAUSE 方法分別對每一個疾病對（MS-IBDs 和 IBDs-MR ）之間的因果關系或基因多效性進行分析。為什么要如此費盡周折呢？這是因為通過多種方法都可以得到一致結果的因果效應將是更穩健更可靠的。在六種 MR 方法中，CAUSE 是唯一一種可以區分因果關系和基因多效性的方法。
這6種 MR 方法的結果如圖4所示，其中的5種在 Bonferroni 閾值 p≤ 8.3×10?3 條件下得到了 MS 對 UC 和 IBD 有一致的因果效應證據，但還不能就此區分 MS-UC(p=0.16) 或MS-IBD(p=0.03)之間到底是因果效應還是基因多效性(p=0.03)。因此進一步做了反向分析，結果發現 IBD 或 UC 對 MS 不存在因果效應，而是符合基因多效性。而 MS 對 UC 應該是有因果效應，但遺憾的在這個分析中還不能百分百確證。因為唯一能說明因果關系與基因多效性的 CAUSE 方法分析 MS 對 UC 的因果檢驗時，結果不顯著。在排除了 MHC 區域的影響之后，再做了一次重復分析也還是得到了，MS 對 UC 有較強的因果效應，但 MS 對 CD 的因果效應證據則比較弱。
圖4. 雙向MR結果，左圖為六個組合在六種方法下的p值；右圖為六個組合在六種方法下的odds ratio，越大表示因果效應越強，越集中代表結果越穩健
第五步， 識別和每種或多種疾病關聯最密切的組織類型。這里使用 S-LDSC 方法來估計每種疾病的 SNP 在各組織中的富集情況。
基本步驟包括：
過濾 GTEx 數據庫中的低質量數據的組織信息；
排除非蛋白編碼基因等對研究產生干擾的基因信息；
計算某種基因在特定組織或細胞中的表達占比，每種組織和細胞類型篩選出前10%的基因作為該組織或細胞特異表達的基因用于下游分析；
使用S-LDSC評估每種疾病 MS 和 IBDs 的 SNP 遺傳力是否顯著富集在特定組織和細胞。
接下來，為了探索免疫相關組織中不同疾病之間共享的遺傳力富集中因組織中的重疊基因區域導致高表達所占的部分，文章里還進行了一系列的條件 S-LDSC。在條件 S-LDSC 分析中，除了對基線模型和所有基因集進行校正外，還針對每個特定的組織和疾病對其他非病灶組織中 Bonferroni 或 FDR 顯著高表達的基因集進行了校正。
最后的結果如圖5，可以看出 MS，IBD，UC，CD 主要在肺、脾、全血、小腸末端回腸等免疫相關組織中富集。其中 MS，IBD，UC 都在小腸末端回腸富集，而 CD 卻沒有。
圖5. 用S-LDSC估計的組織特異性SNP遺傳力富集情況。x軸上每個條帶的長度反映了每種疾病在各組織中SNP遺傳力富集的大小，條帶越長說明有更多的證據認為遺傳力富集顯著，灰色和粉紅色虛線分別表示FDR校正閾值(p < ~5 × 10?3)和Bonferroni校正閾值(p < ~3 × 10?4)。Origin表示根據基線模型和所有基因集進行調整的S-LDSC分析結果。Conditional表示條件S-LDSC分析的結果。
在條件 S-LDSC 分析中，所有這四個組織中 MS 和 IBD 的 SNP 遺傳力富集都是顯著的。而且有意思的是，在這個條件分析中，MS，IBD，CD在肺中顯著富集，而 UC 不顯著。MS，IBD，UC 遺傳力在脾臟和小腸末端回腸顯著富集，CD 不顯著。這就意味著 MS-UC 和 MS-CD 共病的遺傳病因可能富集在不同組織，也就是說不同組織的病變可能是不同 MS-IBDs 共病的基礎。
第六步，將 S-LDSC 應用于 scRNA-seq 數據（共84種細胞類型），評估不同疾病在不同組織的特異細胞類型中的遺傳力富集情況。同樣，在細胞層次，在這個研究中依然使用了條件 S-LDSC。
結果發現肺中的CD4+T細胞在所有四種疾病中仍然有顯著的SNP富集；肺和脾臟的CD+8細胞毒性T細胞在MS和CD中仍然顯著，這意味著這兩種細胞可能與二者共病的易感性相關；而小腸末端回腸的腸上皮祖細胞和早期腸上皮祖細胞中 MS 和 UC 也仍然有顯著富集，這也意味著這兩種細胞可能都與 MS 和 UC 共病相關，但是這項研究的小腸細胞均來自小鼠，所以研究的功效（Power）可能較弱（圖6）。
圖6 細胞特異性的每種疾病SNP富集情況
第七步，為了進一步鑒別 MS 和 IBDs 之間的共同風險基因，這個研究還聯合分析了MS、IBD、UC 和 CD 的 GWAS 匯總數據，以及來自 eQTLGen 聯盟的全血的 cis-eQTL 匯總數據和 GTEx（肺，小腸回腸末端，脾）數據。然后使用 SMR 確定與MS、IBD、UC和CD之間有潛在統計關聯的功能基因。
SMR的基本思想是：執行孟德爾隨機化等效分析，使用 GWAS 和 eQTL 的 Summary statistics，以全基因組顯著 SNPs 作為工具變量，測試基因表達（即exposure）和目標表型（即resuts）之間的關聯，顯著的 SMR 關聯可以用因果效應、遺傳多效性或連鎖解釋。SMR 用 HEIDI-outlier test 來區分因果關系/多效性與連鎖，但目前還沒有辦法區分因果關系和基因多效性。
最終鑒定得到 MS 和 IBDs 唯一共有的基因是 GFR25（SMR顯著，MS顯著，IBD顯著，UC顯著，CD不顯著）。在 MHC 區域，沒有發現基因在 MS 和 IBDs 中有共享。同時還發現了既往報道的基因 DNMT3A 在 MS-IBD 和 MS-CD 的跨性狀薈萃分析中顯示出了相關性。
小結
全文到此就結束了，這個研究涉及到了多個不同的統計學分析方法（包括因果分析方法），分別在遺傳關聯研究的不同情況下進行了應用。這個文章的幾個亮點如下：
使用了多種較新的統計方法來進行疾病遺傳關聯研究，分析很豐富，方法緊跟前沿；
使用了大規模的meta分析的summary statistics，提高了研究的power；
使用了多種孟德爾分析的方法巧妙地確定因果關系。
這個研究給了我們一個如何開展共病遺傳研究的好例子，它在分析 MS 和 IBDs 共病遺傳過程中所用的思路也很有借鑒價值。我也希望通過對這個文章的解讀可以給有需要的朋友們一點啟發。
參考文章
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Wang Lina, Zhang Zuofeng. Mendelian randomization approach, used for causal inferences. Chinese journal of Epidemiology2017, 38(4): 547-552.
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首發于個人公眾號：helixminer（堿基礦工）
