作者通過整合分析scRNA-seq數據、公開發表的scRNA-seq和bulk RNA-seq數據集、空間轉錄組數據、FACS、IF和免疫治療的轉錄組數據，證實FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相互作用參與形成促結締組織增生性TME，阻止淋巴細胞浸潤，可能導致腫瘤免疫治療抵抗，可以作為結直腸癌治療的潛在靶點。
1. A single-cell transcriptomic atlas of paired human normal mucosa and CRC tissues.
作者對5名非轉移性結直腸癌患者的腫瘤樣本和鄰近正常組織進行了單細胞測序，經質控后獲得54103個細胞，共分為9種細胞類型。9種細胞類型在5例患者的腫瘤和癌旁組織中都有，但每種主要細胞類型的浸潤性程度不同，可能反映了結直腸癌進展階段的差異。
2. Characteristics of cell populations in tumor tissues from CRC patients reveals hallmark signatures of TME and prediction of clinical outcome.
Fig 2a：隨后作者探究了這些細胞亞群相關調控通路基因的表達情況。作者使MsigDB數據庫中的hallmark基因集來分析腫瘤組織和鄰近正常組織之間細胞通路的變化。結果顯示與正常組織相比，腫瘤組織中的免疫相關途徑，包括炎癥反應、IL2/STAT5信號和IL6/JAK/STAT3信號，不僅在免疫細胞群（(如髓系細胞和T/ILC細胞）中富集，在MSC和ECs在腫瘤組織中也富集，提示MSCs和ECs也參與抵抗結直腸癌的免疫反應。
與正常樣本相比，腫瘤的MSC、ECs和髓系細胞中缺氧的標志基因集更豐富。這些特征可能反映了腫瘤缺氧區域基質細胞的相互作用，將巨噬細胞、MSC和ECs連接起來，重塑CRC微環境。
做法參考分組水平GSVA和批量GSEA和GSVA分析，把熱圖畫成氣泡圖就行了。
由于單細胞樣本數有限，作者納入了14個數據集，包括TCGA中的 COAD and READ 隊列和GEO中12個獨立的CRC隊列。隨后作者使用CIBERSORT用自己的單細胞數據對這14個數據集進行了反卷積。
Fig 2b：反卷積之后作者做了不同細胞類型比例相關性，發現不同數據集中Myeloid cell和MSCs (間充質基質細胞) 都存在100%的正相關。
這個思路好哎??
Fig 2c：14個數據集的Myeloid cell和MSCs相關性展示。
Fig 2d：并且作者還發現MSC浸潤程度較高的CRC患者與較差的overall survival (OS)和progression-free survival (PFS)相關，髓系細胞浸潤程度高同樣與較差的OS和PFS相關。
3. Tumor-specific FAP+ fibroblasts are associated with colorectal cancer progression.
Fig 3a-c：MSCs和成纖維細胞樣細胞被認為是調節腫瘤發生和癌癥進展的關鍵基質細胞類型。結合前面發現的MSCs與不良預后相關，作者對MSC進行了亞群細分，得到10個亞型。其中FAP+成纖維細胞在腫瘤組織中顯著升高。(FAP是活化成纖維細胞的marker，參考CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury)
Fig 3d, e：公共數據集也顯示腫瘤樣本的FAP+成纖維細胞顯著升高，且與較差的PFS相關。
Fig 3f, g：隨后作者結合了每個細胞群的高表達基因，使用流式對前面的結果進行了驗證，驗證了腫瘤組織中FAP+成纖維細胞的顯著升高。
Fig 3h：隨后作者使用velocity探究了FAP+成纖維細胞的來源，發現它主要由FGFR2+ fibroblasts 或 ICAM1+ telocytes分化而來。
Fig 3i-l：隨后作者使用SCENIC對MSCs進行了轉錄因子預測，發現FAP+成纖維細胞主要受TWIST1等的調控。
Fig 3m：Hif1a通路在FAP+成纖維細胞中也存在顯著激活。
4. Tumor-specific SPP1+ macrophages are associated with CRC progression.
和Fig3的分析思路一模一樣
作者對髓系細胞進行了細分，得到9種亞型。比例變化結果顯示巨噬細胞和中性粒細胞主要存在于腫瘤組織中，而DC在相鄰正常組織中富集。
值得注意的是，SPP1+巨噬細胞是腫瘤特異性巨噬細胞，占腫瘤樣本中髓系細胞的11.6%，但僅占相鄰正常組織中髓樣細胞的0.68%。
TCGA和GSE17536CRC隊列中，SSP1+巨噬細胞高浸潤患者具有更短的PFS。分化軌跡結果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞可能起源于THBS1+巨噬細胞。調節因子分析結果表示SPP1+巨噬細胞主要受到STAT1的調節。
此外，SPP1+巨噬細胞也受到HIF-1信號通路的調節 (Supplementary Fig. 6h, i)。由于FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞都與缺氧誘導的通路密切相關，作者推測在腫瘤的缺氧區域可能存在一個基質細胞介導的網絡，該網絡將巨噬細胞和MSC連接起來，共同促進CRC微環境的惡化。
5. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with worse patient survival.
Fig 5a：作者利用CIBERSORTx在14個獨立的CRC隊列中分析scRNA-seq鑒定到的58個細胞類型的浸潤狀態，結果驗證FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞相關性最高。（和Fig2a的區別是那個做的是細胞大群的相關性，這里做的是所有細胞亞群的相關性。）
Fig 5b：在FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞不同浸潤水平的患者中，二者浸潤均較高的患者(FAP+High_SPP1+High)PFS最短，提示這兩種細胞類型可以協同促進腫瘤進展。
Fig 5c：與FAP+Low_SPP1+Low相比，FAP+High_SPP1+High樣本顯著富集到內皮間質轉化、缺氧、TNF-a和IL-6信號通路。
Fig 5d-e：腫瘤樣本的FAP和SPP1表達均增加。
Fig 5f-h：SPP1和FAP的高表達均與較差的OS和PFS相關。
Fig 5i-j：免疫熒光結果顯示腫瘤組織中FAP和SPP1的表達均特異性增加。且CRC組織中SPP1陽性和FAP陽性細胞細胞在空間上非常接近，提示二者之間可能存在相互作用。
6. Cell–cell interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages revealed by spatial transcriptomics.
為了得到更多的空間信息，作者對五例檢測了單細胞的患者中的四例的腫瘤組織進行了空間轉錄組測序。
Fig 6a-c是Patient6的組織，聚類得到10個cluster。Fig 6a-c是Patient7的組織，聚類得到6個cluster (P8和P7一樣是6個cluster)。P9聚類得到8個cluster(Supplementary Fig. 9d–f)。
Fig 6a-k：結果顯示大多數FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞存在共定位，并包裹惡性上皮細胞(i)。
Fig 6l：FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞中促結締組織增生結構形成的途徑高度活躍，包括細胞外基質組織、膠原纖維組織和對TGF-β的反應。這些現象表明這兩種類型細胞之間可能存在物理相互作用，并可能調節促結締組織增生的微環境以限制免疫細胞浸潤至腫瘤核心。
Fig 6m：T細胞和B細胞被排斥在腫瘤區域以外。
7. FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages interaction may contribute to desmoplastic tumor microenvironment.
為了探究CRC患者中FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞互作時的關鍵調控分子，作者使用NicheNet探究了FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞之間的機制。
Fig 7a：作者發現FAP+成纖維細胞可以通過COL1A1/LAMA1- ITGB1受體配體對和SPP1+巨噬細胞相互作用。此外，FAP+成纖維細胞通過TGF-β超家族基因TGFB1和INHBA的表達來增強SPP1+巨噬細胞的促炎活性，TGF-β可以誘導SPP1+巨噬細胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的表達。
FAP+成纖維細胞還可以通過WNTSA-FZD2和CCL3-CCR5互作增強SPP1+巨噬細胞的招募。此外，FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞還可以通過RARRES2-CMKLR1進行互作。
Fig 7b, c：RARRES2在FAP+成纖維細胞中高表達，而CMKLR1(編碼chemerin的受體) 在SPP1+巨噬細胞和THBS1+巨噬細胞中都存在高表達。前面velocity的結果提示THBS1+巨噬細胞可能是SPP1+巨噬細胞的來源，因此RARRES2-CMKLR1可能驅動THBS1+巨噬細胞向SPP1+巨噬細胞分化。
Fig 7d：CRC患者的chemerin高于正常對照。
Fig 7e-h：NicheNet的結果顯示，SPP1+巨噬細胞高表達細胞因子TGFB1、IL1A和IL1B，可與FAP+成纖維細胞表達的受體結合，促使多種編碼膠原和基質金屬蛋白酶基因靶點的表達。
Fig 7i：對targets的KEGG通路富集結果顯示這些靶點參與多種促炎和ECM增生通路。
Fig 7j：最后作者構建了top3的ligand（TGFB1, IL1B, IL1A）和ECM-related targets的互作網絡，發現了40個下游regulators, 包括HIF1A, AKT1, STAT1 和 NFKB1。這些靶點是促結締組織增生反應的重要組成部分，其中大部分參與ECM通路。
綜上，FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞形成一個相互作用的網絡，支持彼此的維持和功能。這兩種細胞類型可能在ECM重塑中發揮重要作用，可能促進TME促纖維增生區的形成。
8. High infiltration of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages correlates with immunotherapy resistance.
最后作者分析了具有不同FAP+成纖維細胞和/或SPP1+巨噬細胞浸潤模式的腫瘤的局部免疫特征。
結果顯示FAP+High_SPP1+High的腫瘤樣本表現相對高比例的非同義突變和單核苷酸變異（SNV) 預測的新生抗原，并且具有較高的香農嫡指數和TCR豐富度，說明T細胞對新抗原的無效反應。
在所有CRC亞型中，該亞型的淋巴細胞浸潤最低，表明該特定類型腫瘤的微環境特征是免疫排斥型的。
采用IMvigor210公共數據集分析預后相關性發現，FAP或SPP1表達水平高的患者以及FAP和SPP1表達都高的患者具有更短的OS。相比FAP+Low_SPP1+Low的患者，FAP或SPP1High的患者表現出較低的應答，和更多的疾病進展(PD)，這表明FAP或SPP1高表達的患者對抗PD-L1治療的應答明顯低于其他患者。
FAP或SPP1表達水平高的患者以及FAP和SPP1表達都高的患者具有更短的OS。相比FAP和SPP1低表達的患者，FAP或SPP1高表達的患者表現出較低的應答，和更多的疾病進展(PD),SPP1高表達的患者對抗PD-L1治療的應答明顯低于其他患者。
模式圖
1.研究團隊通過整合分析scRNA-seq數據、公開發表的scRNA-seq和bulkRNA-seq數據集、空間轉錄組數據、FACS、IF和免疫治療的轉錄組數據，本研究提供了單細胞分辨率下的配對的腫瘤和癌旁正常組織綜合的TME景觀圖。
2.與癌旁組織相比，結直腸癌組織特異性富集FAP+fibroblasts及SPP1+macrophages，并通過CIBERSORTx對多個結腸癌數據集分析發現這兩種細胞浸潤程度高度相關。
3.研究團隊進一步使用空間轉錄組發現存在同時表達這兩種細胞特征基因的聚類，這一聚類的空間位置和細胞外基質的形成高度相關，提示FAP+fibroblasts和SPP1+macrophages在腸癌中的空間定位上也接近，并圍繞腫瘤中心形成"墻壁"樣的腫瘤邊界。
4.最終證實FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相互作用參與形成促結締組織增生性TME，阻止淋巴細胞浸潤，可能導致腫瘤免疫治療抵抗，可以作為CRC治療的潛在靶點。
