TransDecoder能夠從轉(zhuǎn)錄本序列中鑒定候選編碼區(qū)。這些轉(zhuǎn)錄本序列可以來(lái)自于Trinity的從頭組裝，或者來(lái)自于Cufflinks或者StringTie的組裝結(jié)果。
軟件安裝
從https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases下載最新版的TransDecoder，以v5.5.0為例
mkdir -p ~/opt/biosoft && cd ~/opt/biosoft
wget https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/archive/TransDecoder-v5.5.0.zip
unzip TransDecoder-v5.5.0.zip
mv TransDecoder-TransDecoder-v5.5.0 TransDecoder-v5.5.0
運(yùn)行TransDecoder
我們從cufflinks或stringtie輸出的gtf文件開(kāi)始分析流程，因此你會(huì)有兩個(gè)輸入文件
- transcripts.gtf: 記錄預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本的GTF文件
- genome.fasta: 參考基因組序列
第一步: 從GTF文件中提取FASTA序列
~/opt/biosoft/TransDecoder-v5.5.0/util/gtf_genome_to_cdna_fasta.pl transcripts.gtf genome.fasta > transcripts.fasta
第二步: 將GTF文件轉(zhuǎn)成GFF3格式
~/opt/biosoft/TransDecoder-v5.5.0/util/gtf_to_alignment_gff3.pl transcripts.gtf > transcripts.gff3
第三步: 預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本中長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框, 默認(rèn)是100個(gè)氨基酸，可以用-m修改
~/opt/biosoft/TransDecoder-v5.5.0/TransDecoder.LongOrfs -t transcripts.fasta
第四步: 使用DIAMOND對(duì)上一步輸出的transcripts.fasta.transdecoder.pep在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，尋找同源證據(jù)支持
# 下載數(shù)據(jù)并解壓縮
wget ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz
gunzip uniprot_sprot.fasta.gz
# 建立索引
diamond makedb --in uniprot_sprot.fasta --db uniprot_sprot.fasta
# BLASTP比對(duì)
diamond blastp -d uniprot_sprot.fasta -q transcripts.fasta.transdecoder_dir/longest_orfs.pep --evalue 1e-5 --max-target-seqs 1 > blastp.outfmt6
關(guān)于DIAMOND的使用，參考這篇說(shuō)明DIAMOND: 超快的蛋白序列比對(duì)軟件
第五步: 預(yù)測(cè)可能的編碼區(qū)
~/opt/biosoft/TransDecoder-v5.5.0/TransDecoder.Predict \
-t transcripts.fasta \
--retain_blastp_hits blastp.outfmt6
第六步: 生成基于參考基因組的編碼區(qū)注釋文件
~/opt/biosoft/TransDecoder-v5.5.0/util/cdna_alignment_orf_to_genome_orf.pl \
transcripts.fasta.transdecoder.gff3 \
transcripts.gff3 \
transcripts.fasta > transcripts.fasta.transdecoder.genome.gff3
最終輸出文件如下:
- transcripts.fasta.transdecoder.pep: 最終預(yù)測(cè)的CDS對(duì)應(yīng)的蛋白序列
- transcripts.fasta.transdecoder.cds: 最終預(yù)測(cè)的CDS序列
- transcripts.fasta.transdecoder.gff3: 最終ORF對(duì)應(yīng)的GFF3
- transcripts.fasta.transdecoder.bed: 以BED格式存放ORF位置信息
- transcripts.fasta.transdecoder.genome.gff3: 基于參考基因組的GFF3文件
其中BED和GFF3可以放到IGV上展示，手動(dòng)檢查下結(jié)果
假如是Trinity從頭預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本，沒(méi)有參考基因組，那么就運(yùn)行第三步，第四步和第五步
