一.研究背景

表達(dá)譜的多因素分析是判斷包括腦癌在內(nèi)的多種疾病預(yù)后的有效指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)惡性腫瘤和總生存率(OS)將膠質(zhì)瘤分為四類。而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是生長(zhǎng)迅速的星形細(xì)胞瘤中最惡性的一種(4級(jí)膠質(zhì)瘤)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位OS為9-15個(gè)月，5年生存率低于5%。因此，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的早期診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)是當(dāng)務(wù)之急。

今天小編為大家?guī)磉@篇文章作者在這篇研究中，以EMT和GSCs為研究對(duì)象，利用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的表達(dá)數(shù)據(jù)和OS進(jìn)行多變量分析。最終一些候選基因被確定為潛在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)測(cè)因子。

標(biāo)題：【Promising Prognosis Marker Candidates on the Status of Epithelial–Mesenchymal Transition and Glioma Stem Cells in Glioblastoma】

雜志：Cells? ? ? ?IF:5.656? ? ? 日期：2019.10.24

二.方法和材料

1)????????數(shù)據(jù)：文章使用來自TCGA以及CGGA的具有臨床信息的膠質(zhì)瘤樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)。

2)????????基因注釋：使用GOstat2.5?對(duì)感興趣的基因注釋、可視化和整合，使用數(shù)據(jù)庫(DAVID)進(jìn)行在線注釋.

3)????????聚類分析：基因表達(dá)值通過來自患者的平均值進(jìn)行處理，然后法進(jìn)行層次聚類分析。繪制熱圖，以可視化。

4)????????隨機(jī)生存森林分析：使用隨機(jī)生存森林的方法區(qū)分基因表達(dá)和生存之間的關(guān)系。

5)????????Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析

6)????????Graphical Lasso Estimation來對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行分析

7)????????主成分分析以及生存樹分析

三.結(jié)果展示

1　刻畫EMT和GSC在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)狀態(tài)

這篇文章研究的目的是識(shí)別潛在的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后標(biāo)志物。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由EMT引起和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞維持,在這項(xiàng)研究中,作者使用了來自286個(gè)TCGA和CGGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息，關(guān)注了EMT基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因（圖1）。

TCGA數(shù)據(jù)集的151個(gè)樣本中的126個(gè)基因的表達(dá)以熱圖為代表分級(jí)聚類包括EPI(14個(gè)基因;圖1a)、MES(23個(gè)基因;圖1b)、GLI(53個(gè)基因;圖1c)、GSCs(17個(gè)基因;圖1d)， MTT(34個(gè)基因;圖1e)、PGBs(24個(gè)基因;圖1 f)。然而，能夠?qū)⒒颊叻謱映纱氐牟煌磉_(dá)模式尚未被識(shí)別，這表明基因的差異表達(dá)可能需要聯(lián)合使用來評(píng)估膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后。

因此，作者研究了這些基因組合是否與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EMT和GSC相關(guān)。

?圖1

2　重要變量的重要性以及基因的風(fēng)險(xiǎn)比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后預(yù)測(cè)公式的評(píng)估

作者在這部分使用隨機(jī)生存森林分析顯示每個(gè)基因的變量重要性，以及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示顯著系數(shù)和風(fēng)險(xiǎn)比(HRs)。最終作者得到一個(gè)由22個(gè)基因構(gòu)成的線性公式確定患者的生存。使用中值將患者分成不同組。隨后繪制Kaplan Meier生存曲線(圖2)。

所有低評(píng)分亞組預(yù)后良好，如EPIlow (HR 0.51, 95% CI 0.32 0.81, p = 0.0039;圖2a)， MESlow (HR 0.41, 95% CI 0.27 0.62, p = 1.4 10 5;圖2b)， GLIlow (HR 0.27, 95% CI 0.17 0.42, p = 1.6 10 9;圖2c)， GSClow (HR 0.34, 95% CI 0.21 0.55, p = 3.4 10 6;圖2d)， MTTlow (HR 0.31, 95% CI 0.19 0.51, p = 1.5 10 6;圖2e)、PGBlow (HR 0.29, 95% CI 0.18 0.48, p = 2.7 10 7;圖2 f)。CGGA數(shù)據(jù)集也顯示了類似的結(jié)果。

這些結(jié)果表明，預(yù)后預(yù)測(cè)公式對(duì)評(píng)估膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存是有用的。

圖2

3　遺傳互作以及興趣基因的hub網(wǎng)絡(luò)

作者評(píng)估了基于表達(dá)強(qiáng)度的遺傳相互作用，以檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的hub網(wǎng)絡(luò)和中心因素(圖3)。

包括在遺傳網(wǎng)絡(luò)中基因如下:EPI標(biāo)記中的CLDN1(圖3a);MES標(biāo)記中的CDH11和FN1(圖3b);HDAC1/3/7, FLT1, EGFR, PTEN, MGMT，和PGF的GLI標(biāo)記(圖3c);GSC標(biāo)記中的OLIG2、STAT3、L1CAM和BMI1(圖3d);MTT基因中的HDAC1/3/7、SIRT1和EGFR(圖3e);以及PGBs中的GFAP、TIMP4、IGFBP2、MGMT和GADD45A(圖3f)。其中，一部分MES、GSCs和PGBs的生物標(biāo)志物網(wǎng)絡(luò)也被復(fù)制到CGGA數(shù)據(jù)集中。

這些結(jié)果也揭示了研究的基因?qū)︻A(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后是有幫助的。

圖3

4　評(píng)估EMT, GSCs, MTT, 和PGBs之間的相關(guān)性

作者用主成分分析法檢驗(yàn)了這六程序之間的相關(guān)性。各程序得分由第一主成分積分指數(shù)與歸一化FPKM值之和計(jì)算，將程序間的相關(guān)性引入散點(diǎn)圖矩陣，相關(guān)系數(shù)(r)與統(tǒng)計(jì)顯著性結(jié)合(p < 0.001;圖4)。幾乎所有相關(guān)得分都相對(duì)較高(r > 0.61;圖4)。lasso(圖4b)檢測(cè)到GLI MTT (r = 0.88)和EPI MES (r = 0.71)之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)，而其他細(xì)胞程序如MES PGB (r = 0.38)、PGB GSC (r = 0.30)和GSC GLI (r = 0.25)之間存在微弱的正相關(guān)。然而，在CGGA驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，這些相關(guān)網(wǎng)絡(luò)并沒有被復(fù)制，作者驗(yàn)證了GLI MTT (r = 0.87)、GSC PGB (r = 0.43)和MES PGB (r = 0.43)之間的正相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果提示，將MES和GSC作為惡性狀態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后意義不大。然而，將GLI與GSCs、MTT基因和PGBs的標(biāo)記相結(jié)合，可能會(huì)開發(fā)出新的治療方法和新的候選基因標(biāo)記來預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后。

圖4

5　EMT和GSCs聯(lián)合應(yīng)用評(píng)估膠質(zhì)瘤進(jìn)展

作者研究了一些EMT結(jié)合GSC對(duì)于OS評(píng)估的相關(guān)性，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者使用生存樹分析(圖5)。利用MES和GLI標(biāo)記,MESmiddle MESlowGLIhigh,表現(xiàn)出良好的預(yù)測(cè),而MEShighGLIlow顯示預(yù)后不良(圖5),這表明間充質(zhì)基因的表達(dá)可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后的良好指標(biāo)。MESmiddle比MEShigh預(yù)后更好(圖5b)。使用GLI和GSC標(biāo)記，GSClow預(yù)后良好，而GSChighGLIlow預(yù)后較GSChighGLIhigh差(圖5c)，表明GSC標(biāo)記可能提示惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

此外，與PGBlow相比，PGBhigh和PGBmiddle的預(yù)后較差(圖5d,e)，從而驗(yàn)證了研究使用的候選標(biāo)記和公式。MEShighMTTlow的預(yù)后比MESmiddle差(圖5f)。這表明MTT靶基因表達(dá)的減少導(dǎo)致患者生存能力下降。相比之下，CGGA驗(yàn)證數(shù)據(jù)集顯示EPIlow的預(yù)后優(yōu)于EPImiddle和EPIhigh，這表明EPI基因的過表達(dá)可能能夠區(qū)分腫瘤發(fā)生的起始階段和正常的上皮細(xì)胞分化。綜上所述，包括MES、EPI、GSC、PGBs在內(nèi)的EMT標(biāo)志物的表達(dá)可能提示預(yù)后不良和惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。MES、GLI和MTT基因標(biāo)記聯(lián)合使用可能有助于判斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后。

?圖5

6　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)需要多種評(píng)估

根據(jù)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析和作者之前的研究結(jié)果構(gòu)建了一個(gè)綜合公式，該公式將Kaplan Meier生存曲線除以中位數(shù)分?jǐn)?shù)，顯著HR為3.08 (95% CI 2.04 4.70, p < 0.0001;圖6a)與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集結(jié)果相似(圖6b)。為了確定基于ESI、MES、GLI/GSC標(biāo)志物、PGBs等代表性基因的預(yù)后預(yù)測(cè)作用，作者將之前使用的公式分解為幾個(gè)公式減去各種因素(圖6c)。

發(fā)現(xiàn)沒有GSC的公式(ΔGSC)和MES標(biāo)記(ΔMES)顯示了相反的結(jié)果(圖6 d, e),這表明評(píng)估MES和GSC標(biāo)記組合公式是必不可少的。因此，根據(jù)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展選擇幾個(gè)因素的合理組合，可以保證預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后。

圖6

四.結(jié)論

在這項(xiàng)研究中,作者選擇了包括22個(gè)基因的基因標(biāo)記集如DSG3 FN1, IGFBP2, CLDN1, HDAC7,和L1CAM等,可用于預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后,基于EMT的狀態(tài)評(píng)估等構(gòu)建了預(yù)后預(yù)測(cè)公式，在混合的細(xì)胞程序中，有效地評(píng)估膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存，這將有助于開發(fā)新的治療方法，并為預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后提供新的標(biāo)志物。

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