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下圖為某一條RNAseq從數(shù)據(jù)預處理，序列回帖到數(shù)據(jù)可視化的工作流程，包含了較多的軟件（Linux環(huán)境運行）和若干個包（R語言環(huán)境運行），本系列將按下圖，對每一個步驟進行學習和理解。

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某RNAseq分析方法

Trimmomatic軟件

   承接本RNAseq分析上一部分，F(xiàn)astQC可以得到較詳盡的測序結果質量評估報告，并可以通過分析得到導致測序結果質量較低的原因以利于下一步數(shù)據(jù)清洗和過濾。

Trimmomatic是2014年發(fā)表于Bioinformatics，已經(jīng)引用19074次。主要針對Illumina平臺結果進行分析，其他測序平臺可選擇相應數(shù)據(jù)清洗軟件。

特點：Trimmomatic支持多線程，處理速度很快，主要用來去除 Illumina 平臺的 Fastq 序列中的接頭（adapter），并根據(jù)堿基質量值對 Fastq 進行修剪。軟件有兩種過濾模式，分別對應 SE 和 PE 測序數(shù)據(jù)，同時支持 gzip 和 bzip2 壓縮文件。

簡單應用

雙端測序

   對于大部分測序數(shù)據(jù)，都可以使用較溫和的質量修整和接頭修剪。大部分情況下，不需要前端和末尾修剪（leading and traling clipping）。通常，處理雙端測序文件，*keepBothReads*很有用，這將保留多余的信息，但也會使分析流程更加可供處理。注意，在*keepBothReads*前的2是指在palindrome模式的最小adapter長度，可以被設置為1（默認值為8）。

需要注意的是：Trimmomatic過濾數(shù)據(jù)的命令順序決定其過濾步驟，為了更有效地去除接頭，可在其他過濾命令前，第一步就去除。

java -jar trimmomatic-0.35.jar PE -phred33 input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

不同命令的功能：

1. 移除接頭（ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10）
2. 移除前端低質量序列或N堿基（低于質量3）（LEADING:3）
3. 移除尾端低質量序列或N堿基（低于質量3）（TRAILING:3）
4. 使用4堿基寬度的滑窗掃描讀段，當每堿基平均質量低于15時，進行修剪（SLIDINGWINDOW:4:15）
5. 去除長度小于36堿基的讀段（MINLEN:36）

單端測序

命令參數(shù)：

java -jar trimmomatic-0.35.jar SE -phred33 input.fq.gz output.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

這段命令具體功能見雙端測序。

Trimmomatic介紹

針對Illumina雙端測序和單端測序，Trimmomatic呈現(xiàn)了多種有用的修剪工具。修剪步驟的選擇及其相關的參數(shù)可在命令行上實現(xiàn)。
現(xiàn)有的修剪步驟：

1. ILLUMINACLIP：從讀段中，修剪接頭和其他Illumina特有的序列。

2. SLIDINGWINDOW：提供了一個滑窗修剪工具，一旦在該窗口的平均質量低于某個閾值，即刪除該堿基。

3. LEADING：減去低于質量閾值的讀段首端。

4. TRAILING：減去低于質量閾值的讀段末端。

5. CROP：將讀段剪切為特定的長度

6. HEADCROP：從讀段的首端減去特定長度的堿基。

7. MINLEN：如果低于一定長度，刪除該讀段。

8. TOPHRED33：將質量分數(shù)轉換為Phred-33

9. TOPHRED64：將質量分數(shù)轉換為Phred-64

   對單端測序，需要指定一個輸入和一個輸出文件，加上相應的處理步驟；對雙端測序文件，需要指定兩個輸入文件和四個輸出文件，其中兩個為‘paired’輸出文件（包含一對均經(jīng)過篩選后留下的讀段）和兩個相應的‘unpaired’輸出文件（包含僅有一個讀段成功經(jīng)過篩選）。
   

Trimmomatic運行

雙端模式

java -jar <path to trimmomatic.jar> PE [-threads <threads] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input 1> <input 2> <paired output 1> <unpaired output 1> <paired output 2> <unpaired output 2> <step 1> ...

或

java -classpath <path to trimmomatic jar> org.usadellab.trimmomatic.TrimmomaticPE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input 1> <input 2> <paired output 1> <unpaired output 1> <paired output 2> <unpaired output 2> <step 1> ...

單端模式

java -jar <path to trimmomatic jar> SE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input> <output> <step 1> ...

或

java -classpath <path to trimmomatic jar> org.usadellab.trimmomatic.TrimmomaticSE [-threads <threads>] [-phred33 | -phred64] [-trimlog <logFile>] <input> <output> <step 1> ...