轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)過比對到參考基因組獲得對應(yīng)基因count值后，因?yàn)闇y序深度以及基因長度的關(guān)系，在進(jìn)行差異分析之前，還需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異分析必不可少的一步。

用于轉(zhuǎn)錄組差異分析的目前主要是兩個(gè)軟件：Deseq2 和 edgeR；針對這兩款軟件，學(xué)習(xí)一下目前的應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化方法。

Global normalization methods

通過針對每個(gè)樣本獲得對應(yīng)的大小因子Cj來使不同樣本的計(jì)數(shù)具有可比性，即使這些樣本的排序深度不同。

標(biāo)準(zhǔn)化過程

首先先確定幾個(gè)后續(xù)會(huì)使用的變量

具體計(jì)算函數(shù)如下：

1. Total read count normalization

cpm(..., normalized.lib.sizes = TRUE)? ? ? ?{edgeR}

原理：將庫的大小作為標(biāo)準(zhǔn)化的一種形式是有直觀意義的，因?yàn)閷⒁粋€(gè)樣本測序到一半的深度，平均會(huì)得到映射到每個(gè)基因的讀取數(shù)的一半。

計(jì)算方法：

計(jì)算公式

2.?Upper quantile normalization

calcNormFactors(..…,method="upperquartile",p=0.75)? ? ? {edgeR}

原理：與規(guī)范微陣列數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)類似，本方法是根據(jù)分位數(shù)等參數(shù)匹配基因計(jì)數(shù)的樣本間分布。例如，可以簡單地按樣本的中位數(shù)對其計(jì)數(shù)進(jìn)行縮放。由于零和低計(jì)數(shù)基因的優(yōu)勢，中位數(shù)對不同水平的測序工作沒有提供信息。相反，建議使用每個(gè)樣本的上四分位數(shù)(75-第百分位數(shù))。

計(jì)算方法： 1. 計(jì)算樣本上分位數(shù)（75%）然后按庫大小縮放讀取計(jì)數(shù)

上分位數(shù)

2. 重新計(jì)算總的reads count的上分位數(shù)

調(diào)整后的上分位數(shù)

3. 計(jì)算Cj因子

Cj

Cj

3. Relative Log Expression(RLE)

calcNormFactors(..…, method ="RLE")? ? ? ? ? ?{edgeR}

estimateSizeFactors(...)? ? ? ? ? {DESeq, DESeq2}

4. Trimmed Mean of M-values(TMM)

calcNormFactors(..,method="TMM")? ? ? ?{edgeR}