參考：生物信息學(xué)100個(gè)基礎(chǔ)問題——第1~ 5題 答案公布 - 知乎 (zhihu.com)

掌握FASTQ格式

特點(diǎn)

• 第2行就是測序得到的序列信息，一般用ATCGN來表示，其中N用于熒光信號干擾無法判斷到底是哪個(gè)堿基時(shí)的代表符號；
• 第3行以“+”開始，可以儲(chǔ)存一些附加信息，但目前的測序fastq文件這一行一般是空的。
• 第4行儲(chǔ)存的是質(zhì)量信息，與第2行的堿基序列是一一對應(yīng)的，其中的每一個(gè)符號對應(yīng)的ASCII值是經(jīng)過換算的phred值，可以簡單理解為對應(yīng)位置堿基的測序質(zhì)量值，越大說明測序的質(zhì)量越好。不同的版本對應(yīng)的phred值范圍不同。

什么是phred值，怎么計(jì)算？

是評估這個(gè)bp測序質(zhì)量的值，測序儀通過判斷熒光信號的顏色來判斷堿基的種類，ATCG分別對應(yīng)紅黃藍(lán)綠，信號強(qiáng)弱不同，在這種情況下對每個(gè)結(jié)果的判斷的正確性都存在一個(gè)概率值，這個(gè)值被儲(chǔ)存為ASCII碼形式，轉(zhuǎn)化方式如下：

將該堿基判斷錯(cuò)誤概率值P取log10之后再乘以-10，得到的結(jié)果為Q。
比如，P=1%，那么對應(yīng)的Q=-10*log10（0.01）=20（這個(gè)計(jì)算公式illumina平臺(tái)使用，Solexa系列測序儀使用不同的公示來計(jì)算質(zhì)量值：Q=-10log(P/1-P)）

把這個(gè)Q加上33或者64轉(zhuǎn)成一個(gè)新的數(shù)值，稱為Phred，最后把Phred對應(yīng)的ASCII字符對應(yīng)到這個(gè)堿基。
如Q=20，Phred = 20 + 33 = 53，53在ASCII碼表里對應(yīng)的ASCII符號是”5”

phred33 與 phred64是什么意思？

質(zhì)量字符的ASCII值和質(zhì)量得分的關(guān)系有如下兩種：可以粗略分為 Phred+33和Phred+64，這里的33和64就是指ASCII值轉(zhuǎn)換為Q該減去的數(shù)值。

在處理測序數(shù)據(jù)時(shí)，因?yàn)橐恍┸浖?huì)根據(jù)堿基質(zhì)量得分的不同做不同的處理，常要指定正確的編碼方式，有必要對質(zhì)量字符與質(zhì)量得分的關(guān)系（Phred+33或Phred+64）作出正確的判斷。當(dāng)然，如果處理的是最近兩年產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)，基本上都是Phred+33的，但從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫下載的較早的數(shù)據(jù)可能不同，需要注意。

FASTA格式的構(gòu)成是怎樣的，有什么樣的規(guī)律？

什么序列適合用FASTA保存，什么序列適合用FASTQ保存？

單純的蛋白或者核酸的序列信息一般用FASTA格式保存，而測序文件一般用包含儀器信息和測序質(zhì)量的FASTQ格式保存。

第1代測序 sanger 測序法的原理是什么？通量比較低的核心原因是什么？

sanger法測序及雙脫氧鏈終止法，它采取DNA復(fù)制原理，通過在DNA復(fù)制過程中添加雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）終止DNA鏈的延伸，在DNA鏈不同位置的延伸終止判斷該位置的堿基類型。但是凝膠電泳的時(shí)間較長，導(dǎo)致sanger法測序通量低。

作為2006年正式發(fā)布的illumina測序技術(shù)，或者稱為第2代測序技術(shù)的代表性技術(shù)，其最大的特點(diǎn)是什么？

核心內(nèi)容有兩個(gè)，一個(gè)是橋式PCR，主要用于擴(kuò)大信號；另一個(gè)是4色熒光可逆終止反應(yīng)，使illumina測序可以實(shí)現(xiàn)邊合成邊測序的技術(shù)。

Illumina測序技術(shù)為什么不能像第1代測序技術(shù)一樣測500bp以上？

主要的原因有兩個(gè)，一方面測序時(shí)，經(jīng)過長時(shí)間的PCR，會(huì)有不同步的情況。比如一開始1個(gè)cluster中是100個(gè)完全一樣的DNA鏈，但是經(jīng)過1輪增加堿基，其中99個(gè)都加入了1個(gè)堿基，顯示了紅色，另外1個(gè)沒有加入堿基，不顯示顏色。這時(shí)候整體為紅色，我們可以順利得到結(jié)果。隨后，在第2輪再加入堿基進(jìn)行合成的時(shí)候，之前沒有加入的加入了1個(gè)堿基顯示紅色，剩下的99個(gè)顯示綠色，這個(gè)時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)雜信號。當(dāng)測序長度不斷延長，這個(gè)雜信號會(huì)越來越多，最后很有可能出現(xiàn)50個(gè)紅，50個(gè)綠色，這時(shí)信號不足以判斷堿基類型；第二就是測序過程中合成酶的活性越來越不穩(wěn)定，后面堿基添加出現(xiàn)問題。

什么是Illumina測序adapter？同一批上機(jī)的adapter序列一樣嗎？它的作用是什么？

adapter的中文意思為適配器或者接口，在illumina測序過程中關(guān)鍵一步是將文庫片段固定在flowcell上，然后通過橋式PCR將片段擴(kuò)增，在被打斷成300~500bp的長度的片段末端被補(bǔ)平后adaptor將被添加到片段兩端，一方面用于將片段固定在flowcell上，同時(shí)adaptor中還包含橋式PCR所需要的引物

一個(gè)完整的Illumina測序過程是那幾步？

完整的測序過程僅包含兩步，第一是橋式PCR擴(kuò)增，第二是以4色熒光可逆終止反應(yīng)為核心技術(shù)的測序；

什么是橋式PCR技術(shù)？為什么要進(jìn)行橋式PCR？

加上adaptor之后的DNA樣品與flowcell上固定的oligo（寡鏈核苷酸）匹配后就被固定在flowcell上，通過橋式PCR進(jìn)行擴(kuò)增成cluster,便于后面的熒光測序，主要步驟為：

進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將序列補(bǔ)成雙鏈。加入NaOH強(qiáng)堿性溶液破壞DNA的雙鏈，并洗脫。由于最開始的序列是使用化學(xué)鍵連接的，所以不會(huì)被洗。
加入緩沖溶液，這時(shí)候序列自由端的部分就會(huì)和旁邊的oligo進(jìn)行匹配
進(jìn)行一輪PCR，在PCR的過程中，序列是彎成橋狀，所以叫橋式PCR，一輪橋式PCR可以使得序列擴(kuò)增1倍。
如此循環(huán)下去，就會(huì)得到一個(gè)具有完全相同序列的cluster

我們都說，測序結(jié)果會(huì)包含index，那么index是什么？有什么作用？

一條lane能測得的數(shù)據(jù)量在30G左右，而一個(gè)樣品的測序量一般不會(huì)這么大，所以在建庫的時(shí)候?qū)γ恳环N樣品的接頭加上不同的標(biāo)簽序列，這個(gè)標(biāo)簽就叫做Index，有了index就可以同時(shí)在一個(gè)lane中測多種數(shù)據(jù)了，后期可以根據(jù)index將數(shù)據(jù)分開；

我們所說的flowcell，lane，tile都是什么意思？

• flowcell 是指Illumina測序時(shí)，測序反應(yīng)發(fā)生的位置，1個(gè)flowcell含有8條lane
• lane 每一個(gè)flowcell上都有8條泳道，用于測序反應(yīng)，可以添加試劑，洗脫等等
• tile 每一次測序熒光掃描的最小單位

Illumina測序結(jié)果質(zhì)量表示方法采用的是Phred33還是Phred64？

最新的測序質(zhì)量結(jié)果一般都為Phred33，但是早期的測序數(shù)據(jù)可能出現(xiàn)Phred64。

llumina目前主流的測序儀都有哪幾種型號？各自大概的通量是多少？（也就是1個(gè)run能跑出多少數(shù)據(jù)）

目前主流的測序儀及其通量主要是Hiseq2500（50-1000Gb）、Hiseq3000（125-750Gb）、Hiseq4000（125-1500Gb）、Hiseq X Five（900-1800Gb）和Hiseq X Ten（900-1800Gb）

Illumina目前的測序技術(shù)，最核心的就是邊合成邊測序，即我們常說的 Sequencing by synthesis （SBS），那么為什么能夠?qū)崿F(xiàn)SBS？

經(jīng)過橋式PCR之后同一段序列已經(jīng)成簇，下一段就是開始進(jìn)行測序，這一步比較簡單，就是加入primer，然后添加經(jīng)過特殊處理的ATCG四種堿基，特殊的地方有兩點(diǎn)：一個(gè)是堿基部分加入了熒光基團(tuán)，可以激發(fā)出不同的顏色，另一個(gè)是脫氧核糖3號位加入了疊氮基團(tuán)而不是常規(guī)的羥基，這個(gè)疊氮集團(tuán)保證了每次只能夠在序列上添加1個(gè)堿基.
這樣每1輪測序，保證只有1個(gè)堿基加入的當(dāng)前測序鏈。這時(shí)候測序儀會(huì)發(fā)出激發(fā)光，并掃描熒光。因?yàn)橐粋€(gè)cluster中所有的序列是一樣的，所以理論上，這時(shí)候cluster中發(fā)出的熒光應(yīng)該顏色一致。隨后加入試劑，將脫氧核糖3號位的—N2改變成—OH，然后切掉部分熒光基團(tuán)，使其在下一輪反應(yīng)中，不再發(fā)出熒光。如此往復(fù)，就可以測出序列的內(nèi)容。

Illumina測序技術(shù)為什么不能像第1代測序技術(shù)一樣測500bp以上？”，這里面主要涉及到兩種錯(cuò)誤，一種叫phasing，一種叫pre-phasing，分別是什么意思？

通俗來講phasing表示本來同步添加的堿基有一些沒加上，而pre-phasing則是加多了，都會(huì)導(dǎo)致當(dāng)前bp的熒光檢測出現(xiàn)噪音，造成phasing的主要原因是合成酶的活性降低，而pre-phasing則可能是疊氮基團(tuán)性質(zhì)不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化為羥基在一步檢測中添加了不止一個(gè)堿基。

adapter是什么意思？adapter與primer有什么區(qū)別？

adapter在中文是適配器或者接口的意思，在前面的內(nèi)容中已經(jīng)提到將測序序列打碎成片斷后要將末端補(bǔ)平然后添加adapter，用于與flowcell上的oligo匹配固定并為后續(xù)橋式PCR做準(zhǔn)備，而前面提到的Index與adapter之間的位置關(guān)系一般為adapter1-Index-fragment-adapter2，adapter2通過與oligo互補(bǔ)連接在flowcell上，在進(jìn)行完橋式PCR之后進(jìn)行測序時(shí)，添加primer，這一段primer的序列是與Index互補(bǔ)的而非adapter1，所以最終拿到的測序結(jié)果應(yīng)該是Index+fragment+adapter2或者Index+部分fragment

比如最終的測序結(jié)果是 AATTCCGGATCGATCG...，那么adapter的序列可能出現(xiàn)在哪一端，還是兩端都有可能出現(xiàn)？為什么？

一般出現(xiàn)在3'端，在上面第1題中已經(jīng)說到，最終的測序結(jié)果應(yīng)該是Index+fragment+adapter2或者Index+部分fragment，也就是說測序的方向是從5'到3'，adapter只可能出現(xiàn)在3'端。