(一) 什么是雙熒光素酶？
答：雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲熒光素是從甲蟲（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報告實驗中得到廣泛應(yīng)用，它們的發(fā)光原理如下所示：
(二) 為什么要采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)？
答：單報告基因?qū)嶒炌鶗艿礁鞣N實驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。
(三) 雙熒光素酶在miRNA驗證其靶基因方面的原理是什么？
答：雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細(xì)胞中同時表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒有交叉干擾。得益于超強(qiáng)的光信號和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于 miRNA 靶基因驗證。 miRNA 主要通過作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以將目的基因 3’UTR 區(qū)域構(gòu)建至載體中報告基因 luciferase 的后面，通過比較過表達(dá)或者干擾 miRNA 后，報告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映 miRNA 對目的基因的抑制作用，也即用熒光值來判斷miRNA是否和靶基因結(jié)合。
(四) 在利用雙熒光素酶驗證miRNA的靶基因方面，插入的3’UTR長度應(yīng)該是多少？
答：靶基因的3’UTR長度不一，將全長都插入載體中不切實際，通常只插入包括miRNA結(jié)合位點前后200bp左右的序列，大概就是400bp[1]，但也有文獻(xiàn)插入的是80個bp[2]，有文獻(xiàn)選擇了200多個bp[3]，但嚴(yán)格來講，應(yīng)該選擇400bp，以結(jié)合位點為中心，上游200bp，下游200bp。
(五) 常用的雙熒光素酶載體有哪些？
答：常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上，第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上。以第一種為例，這兩種載體分別為pMIR-REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開發(fā)的載體，它用來克隆插入miRNA靶序列，評估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能的載體，該載體的圖譜如下所示：
另外的一個載體是pRL-TK載體，這個載體是由Promega開發(fā)的，pRL-TK是海腎熒光素酶報告載體，含有SV40增強(qiáng)子，質(zhì)粒圖譜如下所示：
從這兩個圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA這個載體主要是用于評估m(xù)iRNA與靶基因3’UTR的結(jié)合，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而pRL-TK這個載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來檢測熒光時，pRL-TK這個質(zhì)粒起到一個內(nèi)參的作用。
第二種方案就是將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個載體上，這樣偏差更小，畢竟轉(zhuǎn)染一個質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒要容易，在這方面，根據(jù)檢索到的資料顯示，現(xiàn)在的這類質(zhì)比較有名的是Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒，圖譜如下所示：
另外的質(zhì)粒就是國產(chǎn)的，即復(fù)能基因的pEZX-MT06質(zhì)粒，圖譜如下所示：
(六) 在檢測miRNA靶基因時，需要設(shè)置多少個分組？
答：首先要知道，插入的靶基因原始3’UTR的質(zhì)粒叫野生型質(zhì)粒，除此之外，還需要在螢火蟲熒光素酶3’UTR插入miRNA結(jié)合位點突變的序列載體，這個質(zhì)粒通常叫突變型質(zhì)粒，最后還有各種對照載體，包括螢火蟲熒光素酶空載體，miRNA空載體，還有海腎素?zé)晒廨d體，以文獻(xiàn)中的案例[4]說明，此文獻(xiàn)使用了6組來進(jìn)行驗證，其分組以及分組說明如下所示：
注：pGL3是熒光素酶報告質(zhì)粒，綠色的是對照組，即不加miRNA質(zhì)粒，紅色的是正常組，加miRNA質(zhì)粒。思路即為熒光素酶質(zhì)粒（3種情況：①空質(zhì)粒；②加了WT靶基因3’UTR的質(zhì)粒；③加了MUT的靶基因3’UTR的質(zhì)粒）×miRNA precursor（兩種情況，即加與不加），經(jīng)排列組合，即為6組，詳細(xì)說明如下所示：
第一組 熒光素酶質(zhì)粒pGL3不加3’UTR片段 + miRNA載體質(zhì)粒
第二組 熒光素酶質(zhì)粒pGL3不加3’UTR片段 + miR-200c質(zhì)粒
第三組 熒光素酶質(zhì)粒pGL3 -WT-3’UTR+ + miRNA載體質(zhì)粒
第四組 重點：熒光素酶質(zhì)粒pGL3 -WT3’UTR + miR-200c質(zhì)粒
第五組 熒光素酶質(zhì)粒pGL3 -MUT-3‘UTR+ miRNA載體質(zhì)粒
第六組 重點：熒光素酶質(zhì)粒pGL3 -MUT-3‘UTR + miR-200c質(zhì)粒
理想結(jié)果：第四組降低，即miRNA能夠與靶基因的3UTR結(jié)合，第六組不變，即突變后靶基因3‘UTR不與miRNA結(jié)合。
(七) 在檢測熒光方面，所使用的儀器是哪些？
答：最經(jīng)典的儀器就是Promega的GloMax 20/20 發(fā)光檢測儀，但這種儀器只適合一次檢測一個醞釀。但也可以用多功能酶標(biāo)儀來檢測（本實驗室的儀器是VARIOSKAN LUX），這種酶標(biāo)儀可以實現(xiàn)多通量檢測。螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長480nm。
(八) 測得結(jié)果的數(shù)據(jù)如何處理？
答：測得的結(jié)果一個螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光信號，記為RL1，，海腎熒光素酶產(chǎn)生的信號，記為RL2。RL1/RL2將數(shù)據(jù)均一化后，每兩組之間用ANOVA檢測即可。
(九) 參考資料
- Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.
- Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.
- Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.
- Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.
