hisat2 -t -x ~/rna_seq_analysis/reference/index/hg19/genome -1 ~/rna_seq_analysis/fastq/SRR5894154_1.fastq.gz -2 ~/rna_seq_analysis/fastq/SRR5894154_2.fastq.gz -S ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154.sam
之前出問題好像是因為少空了空格。
http://blog.sciencenet.cn/blog-3334560-1078097.html
得到的sam格式文件40多G。。。。
我哭了。。。
下一步把sam文件轉(zhuǎn)化為bam文件，用samtools
SAM格式是目前用來存放大量核酸比對結果信息的通用格式，也是人類能夠“直接”閱讀的格式類型，而BAM和CRAM是為了方便傳輸，降低存儲壓力將SAM進行壓縮得到的格式形式。?注，BAM格式必須要建立索引才能快速讀取指定位置的信息。
# 1.3版本前
samtools view -bS bwa.sam > bwa.bam
samtools sort bwa.bam > bwa_sorted.bam
samtools index bwa_sorted.bam
# 1.3版本后
samtools sort bwa.sam > bwa_sorted.bam
samtools index bwa_sorted.bam
1. 格式轉(zhuǎn)換
2. 排序
3. 索引
大于號：將一條命令執(zhí)行結果（標準輸出，或者錯誤輸出，本來都要打印到屏幕上面的）重定向其它輸出設備（文件，打開文件操作符，或打印機等等）
1. samtools view -S SRR5894154.sam -b > SRR5894154.bam? ?
bam文件不到8g，于是趕緊把sam文件刪了～
2.?samtools sort SRR5894154.bam > SRR5894154_sorted.bam
3. samtools index SRR5894154_sorted.bam
//雖然我不知道第三步有什么用。。。
如果你要比較同一個樣本(within-sample)不同基因之間的表達情況，你就需要考慮到轉(zhuǎn)錄本長度，因為轉(zhuǎn)錄本越長，那么檢測的片段也會更多，直接比較等于讓小孩和大人進行賽跑。如果你是比較不同樣本（across sample）同一個基因的表達情況，雖然不必在意轉(zhuǎn)錄本長度，但是你要考慮到測序深度（sequence depth)，畢竟測序深度越高，檢測到的概率越大。除了這兩個因素外，你還需要考慮GC%所導致的偏差，以及測序儀器的系統(tǒng)偏差。目前對read count標準化的算法有RPKM（SE）, FPKM（PE），TPM, TMM等，不同算法之間的差異與換算方法已經(jīng)有文章進行整理和吐槽了。
在轉(zhuǎn)錄本水平上，一般常用工具為Cufflinks和它的繼任者StringTie， eXpress。這些軟件要處理的難題就時轉(zhuǎn)錄本亞型（isoforms）之間通常是有重疊的，當二代測序讀長低于轉(zhuǎn)錄本長度時，如何進行區(qū)分？這些工具大多采用的都是expectation maximization（EM）。好在我們有三代測序。上述軟件都是alignment-based，目前許多alignment-free軟件，如kallisto, silfish, salmon，能夠省去比對這一步，直接得到read count，在運行效率上更高。不過最近一篇文獻[1]指出這類方法在估計豐度時存在樣本特異性和讀長偏差。
-f bam/sam： 指定輸入文件格式，默認SAM
-r name/pos: 你需要利用samtool sort對數(shù)據(jù)根據(jù)read name或者位置進行排序，默認是name
-s yes/no/reverse: 數(shù)據(jù)是否來自于strand-specific assay。DNA是雙鏈的，所以需要判斷到底來自于哪條鏈。如果選擇了no， 那么每一條read都會跟正義鏈和反義鏈進行比較。默認的yes對于雙端測序表示第一個read都在同一個鏈上，第二個read則在另一條鏈上。
-a 最低質(zhì)量， 剔除低于閾值的read
-m 模式 union（默認）, intersection-strict and intersection-nonempty。一般而言就用默認的，作者也是這樣認為的。
-i id attribute: 在GTF文件的最后一欄里，會有這個基因的多個命名方式（如下）， RNA-Seq數(shù)據(jù)分析常用的是gene_id， 當然你可以寫一個腳本替換成其他命名方式。
gene_id "ENSG00000223972.5_2"; transcript_id "ENST00000456328.2_1"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-002"; exon_number 2; exon_id "ENSE00003582793.1_1"; level 2;.
htseq-count -s no?-r pos? -f bam ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154_sorted.bam ~/rna_seq_analysis/human_genome/gencode.v28lift37.annotation.sorted.gff3 > ~/rna_seq_analysis/aligned/SRR5894154.count
