GM1神經(jīng)節(jié)苷脂抗帕金森病的新機(jī)制:自噬依賴性去除α-突觸核蛋白

前言

帕金森病(PD)是最普遍的神經(jīng)退行性疾病之一,影響2%-3%的65歲及以上人群。一般來說,PD的特征是中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性缺失。研究人員已經(jīng)報道了PD的多種分子機(jī)制,如線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、軸突運輸、Ca2+穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)炎癥。特別是,α-synuclein (α-Syn) (路易體的胞內(nèi)成分)被認(rèn)為是PD最重要的神經(jīng)病理學(xué)特征之一。在PD患者的多巴胺能神經(jīng)元、MPTP(四氫吡啶)處理的動物和MPP+(MPTP代謝物)處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中觀察到α-Syn的積累。此外,有研究報道,α-Syn突變(A30P、A53T和E46K)是罕見家族性PD的主要原因。

因此,清除α-Syn為帕金森病的治療提供了一種合理的途徑。自噬被認(rèn)為在降解細(xì)胞內(nèi)α-Syn聚集物中起著重要作用。Rapamycin(雷帕霉素)已被證明通過誘導(dǎo)自噬減少α-Syn聚集,從而在體內(nèi)和體外保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元抵抗死亡。不幸的是,Rapamycin缺乏特異性,常常導(dǎo)致口腔和呼吸道感染、白細(xì)胞減少、口腔炎、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、免疫抑制等多種副作用,從而限制了Rapamycin在PD治療中的應(yīng)用。因此,目前迫切需要尋找其他能夠清除α-Syn聚集物但副作用更少的PD候選治療方法。

GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(18:1/18:0)是一種主要的腦神經(jīng)節(jié)苷脂,由三個結(jié)構(gòu)單元組成:一個低聚糖,一個神經(jīng)酰胺錨點和幾個唾液酸殘基。由于其對神經(jīng)元可塑性、神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放、神經(jīng)傳遞以及與神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的相互作用的調(diào)節(jié)作用,這種分子被認(rèn)為是各種大腦功能中必不可少的調(diào)節(jié)劑。外源性神經(jīng)節(jié)苷脂已經(jīng)被證明可以影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多巴胺能、谷氨酸能和膽堿能神經(jīng)元的存活。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的治療作用已在PD患者,以及MPTP治療的小鼠和靈長類動物,顯示神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)修復(fù)作用。盡管有這些積極的數(shù)據(jù),但GM1神經(jīng)節(jié)苷脂治療PD的確切機(jī)制仍不確定。在以前的報道中,這種治療方法被猜測以自噬依賴的方式降解α-Syn,這促使作者研究自噬是否參與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的抗PD機(jī)制。

研究結(jié)果

1. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂改善了C57BL/6 J小鼠MPTP誘導(dǎo)的行為缺陷,并恢復(fù)了多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平

MPTP被酶MAO-B轉(zhuǎn)化為毒性代謝物MPP+,通過抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I殺死多巴胺能神經(jīng)元。因此,MPTP和MPP+通常分別在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)一種與PD相似的神經(jīng)元細(xì)胞毒性綜合征。在本研究中,C57BL/6 J小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg) 5天建立PD模型,以評估GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的保護(hù)作用。治療2周后,進(jìn)行行為測試,包括爬桿測試、旋轉(zhuǎn)測試和步態(tài)分析。如(圖1a)所示,MPTP處理的小鼠比對照組小鼠花更多的時間爬桿。相比之下,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(靜脈注射,25和50 mg/k)和selegiline(司來吉林MAO-B抑制劑,靜脈注射,60 mg/kg)顯著減少MPTP治療的小鼠爬桿時間。在旋轉(zhuǎn)測試中,MPTP處理顯著降低了下降潛伏期,為MPTP所致的運動功能障礙。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和selegiline可抑制MPTP誘導(dǎo)的下降潛伏期的下降(圖1b)。

作者進(jìn)一步評估了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對步態(tài)的治療作用,通過包括步速、擺動速度、步頻、跑步持續(xù)時間和步行速度等參數(shù)的貓步試驗。如(圖1c-g)所示,MPTP處理小鼠的擺動速度和步頻顯著下降,而在步數(shù)周期、跑步持續(xù)時間和步行速度上,則觀察到顯著增加。相比而言,GM1神經(jīng)節(jié)苷和selegiline的治療有效改善了MPTP引起的這些步態(tài)行為障礙(圖1c-g)。此外,GM1神經(jīng)節(jié)苷治療恢復(fù)了步態(tài)表現(xiàn)(圖1k)。在MPTP處理的小鼠中,增加了四肢的觸摸和懸掛次數(shù)(圖1l),和步法模式的數(shù)量(圖1m)。這些行為測試提示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對PD有明顯的治療作用。值得注意的是,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂在三個行為測試中的保護(hù)作用被3-MA(自噬抑制劑)逆轉(zhuǎn)(圖1 a-g和k-m)。這一發(fā)現(xiàn)表明,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的保護(hù)作用可能與自噬有關(guān)。

此外,采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測小鼠紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平。如(圖1h-j)所示,MPTP處理顯著降低了多巴胺、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的水平。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和selegiline治療可防止MPTP誘導(dǎo)的多巴胺、DOPAC和HVA水平減少,提示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂能有效改善多巴胺能神經(jīng)元的功能。

2. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂改善MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,減少神經(jīng)元細(xì)胞中α-Syn的積累

MPTP的代謝物MPP+在體外可導(dǎo)致神經(jīng)毒性。因此,作者進(jìn)一步利用MPP+驗證GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。如(圖2a)所示,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂濃度小于320μM時不引起任何細(xì)胞毒性。MPP+?(1 mM)顯著抑制細(xì)胞增殖,而不同濃度的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(20、40和80 μM)處理可顯著減弱MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制(圖2b)。此外,MPP+導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,偽足減少,胞體拉長,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂使其恢復(fù)(圖2c)。Western blot分析顯示,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞鐘α-Syn積累(圖2d)。同樣,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂以時間依賴性的方式降低了PC12α-Syn A53T細(xì)胞中的α-Syn過表達(dá)作用(圖2e)。

線粒體功能缺陷和氧化應(yīng)激已在PD的發(fā)病機(jī)制中得到證實。如(圖2g和h)所示,1 mM MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞36 h后,線粒體膜電位(δ ψ m)明顯降低,ROS水平升高,而GM1神經(jīng)節(jié)苷脂治療明顯抑制了這些變化。此外,自噬抑制劑(3-MA或bafilomycin A1)可消除GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的治療效果。這些體外研究結(jié)果與MPTP處理的小鼠的觀察結(jié)果一致,進(jìn)一步提示自噬激活參與了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對PD的保護(hù)作用。

3. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞自噬

已有研究報道GM1神經(jīng)節(jié)苷脂可誘導(dǎo)促進(jìn)多種細(xì)胞系自噬。體外實驗顯示,不同劑量的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理SH-SY5Y細(xì)胞后,自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II增加和自噬底物SQSTM1/p62的降解均增強,特別是在40 μM(圖3a)。另外,在該劑量下,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞處理24 h后,這些自噬相關(guān)蛋白的影響最為明顯(圖3b)。為更直觀的觀察GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用,作者使用mRFP-GFP-LC3標(biāo)記進(jìn)行自噬通量測定。Rapamycin(雷帕霉素)通過抑制mTOR[45]發(fā)揮自噬誘導(dǎo)作用,作為陽性對照。由于GFP對低pH條件敏感,當(dāng)自噬小體與溶酶體融合時,GFP(綠色)熒光被熄滅,只能觀察到mRF(紅色)熒光。當(dāng)GFP和mRFP(黃色)熒光同時出現(xiàn)時,說明自噬小體不與溶酶體結(jié)合。與對照組相比,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和Rapamycin處理的細(xì)胞中紅色斑點明顯增多,而GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和bafilomycin A1聯(lián)合處理可增強黃色斑點(圖3c),說明GM1神經(jīng)節(jié)苷脂增強了SHSY5Y細(xì)胞的自噬通量。

4. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬有助于清除α-Syn

由于去除異常的α-Syn為PD的治療提供了一個很有潛力的策略,早期研究表明自噬介導(dǎo)的α-Syn降解有利于對PD的保護(hù)作用。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對MPTP誘導(dǎo)的小鼠及MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞的保護(hù)作用被3-MA和bafilomycin A1阻斷,說明可能與自噬激活有關(guān)。如預(yù)期的那樣,3-MA顯著消除了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞中α-Syn蛋白水平的影響(圖4a)。作者隨后進(jìn)一步確定GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對自噬過程的影響。數(shù)據(jù)顯示,MPP+存在下,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理明顯促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化,同時自噬底物SQSTM1/p62蛋白水平下降(圖4b)。此外,透射電鏡顯示,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理小鼠的黑質(zhì)中存在明顯的自噬泡(圖4c)。重要的是,共聚焦顯微鏡圖像顯示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)的自噬小體與MPP+誘導(dǎo)的α-Syn共定位(圖4d)。這些體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬,參與α-Syn清除。

此外,作者使用doxycycline誘導(dǎo)α-Syn A53T表達(dá)的PC12α-Syn A53T細(xì)胞,驗證GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對自噬和α-Syn清除的影響。共聚焦顯微鏡結(jié)果(圖5a)顯示,在PC12α-Syn A53T細(xì)胞中,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理后LC3斑點增加,而doxycycline誘導(dǎo)的α-Syn積累減少,其中LC3和α-Syn的共定位顯著增強(圖5a)。Western blot分析證實,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂導(dǎo)致α-Syn蛋白水平下降,而3-MA共處理逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(圖5b)。與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂類似,Rapamycin也能強烈降低α-Syn水平(圖5b)。作者采用化學(xué)反應(yīng)方法,用熒光FITC熒光標(biāo)記GM1神經(jīng)節(jié)苷脂。在受GM1-FITC處理的PC12α-Syn A53T細(xì)胞中觀察到強烈的綠色熒光(圖5c)。同時,在PC12α-Syn A53T細(xì)胞中,GM1-FITC和α-Syn以及GM1-FITC和LC3之間觀察到明顯的共定位(圖5d)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬來清除α-Syn的積累。

5. ATG13-ULK1復(fù)合物參與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)的自噬

ULK復(fù)合體由ULK1、ATG13、FIP200和ATG101組成,它們是啟動自噬過程所必需的。作者評估了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對ULK1和ATG13蛋白表達(dá)水平的影響。值得注意的是,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理促進(jìn)了PC12α-Syn A53T細(xì)胞中ATG13和ULK1的磷酸化(圖6a)。然而,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的作用被3-MA抑制(圖6a)。同樣,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理的SH-SY5Y細(xì)胞也顯示出p-ATG13/ATG13的比例增加,而3-MA處理抑制了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的這種作用(圖6b)。綜上所述,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂通過激活A(yù)TG13-ULK1復(fù)合物來誘導(dǎo)自噬。

總結(jié)

總的來說,作者通過MPTP/MPP+處理建立了α-Syn過表達(dá)模型,以評估GM1在體內(nèi)和體外對PD的治療作用。此外,使用表達(dá)誘導(dǎo)型α-Syn的PC12α-Syn A53T細(xì)胞來證明GM1和α-Syn之間的直接關(guān)系。研究結(jié)果表明,自噬的激活解釋了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的抗PD作用,并為GM1神經(jīng)節(jié)苷脂清除α-Syn的機(jī)制提供了可能的理論基礎(chǔ)。

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