前言

帕金森病(PD)是最普遍的神經(jīng)退行性疾病之一，影響2%-3%的65歲及以上人群。一般來說，PD的特征是中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性缺失。研究人員已經(jīng)報道了PD的多種分子機(jī)制，如線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、軸突運輸、Ca2+穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)炎癥。特別是，α-synuclein (α-Syn) （路易體的胞內(nèi)成分）被認(rèn)為是PD最重要的神經(jīng)病理學(xué)特征之一。在PD患者的多巴胺能神經(jīng)元、MPTP（四氫吡啶）處理的動物和MPP+（MPTP代謝物）處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中觀察到α-Syn的積累。此外，有研究報道，α-Syn突變(A30P、A53T和E46K)是罕見家族性PD的主要原因。

因此，清除α-Syn為帕金森病的治療提供了一種合理的途徑。自噬被認(rèn)為在降解細(xì)胞內(nèi)α-Syn聚集物中起著重要作用。Rapamycin（雷帕霉素）已被證明通過誘導(dǎo)自噬減少α-Syn聚集，從而在體內(nèi)和體外保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元抵抗死亡。不幸的是，Rapamycin缺乏特異性，常常導(dǎo)致口腔和呼吸道感染、白細(xì)胞減少、口腔炎、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、免疫抑制等多種副作用，從而限制了Rapamycin在PD治療中的應(yīng)用。因此，目前迫切需要尋找其他能夠清除α-Syn聚集物但副作用更少的PD候選治療方法。

GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(18:1/18:0)是一種主要的腦神經(jīng)節(jié)苷脂，由三個結(jié)構(gòu)單元組成：一個低聚糖，一個神經(jīng)酰胺錨點和幾個唾液酸殘基。由于其對神經(jīng)元可塑性、神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放、神經(jīng)傳遞以及與神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的相互作用的調(diào)節(jié)作用，這種分子被認(rèn)為是各種大腦功能中必不可少的調(diào)節(jié)劑。外源性神經(jīng)節(jié)苷脂已經(jīng)被證明可以影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多巴胺能、谷氨酸能和膽堿能神經(jīng)元的存活。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的治療作用已在PD患者，以及MPTP治療的小鼠和靈長類動物，顯示神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)修復(fù)作用。盡管有這些積極的數(shù)據(jù)，但GM1神經(jīng)節(jié)苷脂治療PD的確切機(jī)制仍不確定。在以前的報道中，這種治療方法被猜測以自噬依賴的方式降解α-Syn，這促使作者研究自噬是否參與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的抗PD機(jī)制。

研究結(jié)果

1. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂改善了C57BL/6 J小鼠MPTP誘導(dǎo)的行為缺陷，并恢復(fù)了多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平

MPTP被酶MAO-B轉(zhuǎn)化為毒性代謝物MPP+，通過抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I殺死多巴胺能神經(jīng)元。因此，MPTP和MPP+通常分別在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)一種與PD相似的神經(jīng)元細(xì)胞毒性綜合征。在本研究中，C57BL/6 J小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg) 5天建立PD模型，以評估GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的保護(hù)作用。治療2周后，進(jìn)行行為測試，包括爬桿測試、旋轉(zhuǎn)測試和步態(tài)分析。如（圖1a）所示，MPTP處理的小鼠比對照組小鼠花更多的時間爬桿。相比之下，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂（靜脈注射，25和50 mg/k）和selegiline（司來吉林MAO-B抑制劑，靜脈注射，60 mg/kg）顯著減少MPTP治療的小鼠爬桿時間。在旋轉(zhuǎn)測試中，MPTP處理顯著降低了下降潛伏期，為MPTP所致的運動功能障礙。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和selegiline可抑制MPTP誘導(dǎo)的下降潛伏期的下降（圖1b）。

作者進(jìn)一步評估了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對步態(tài)的治療作用，通過包括步速、擺動速度、步頻、跑步持續(xù)時間和步行速度等參數(shù)的貓步試驗。如（圖1c-g）所示，MPTP處理小鼠的擺動速度和步頻顯著下降，而在步數(shù)周期、跑步持續(xù)時間和步行速度上，則觀察到顯著增加。相比而言，GM1神經(jīng)節(jié)苷和selegiline的治療有效改善了MPTP引起的這些步態(tài)行為障礙(圖1c-g)。此外，GM1神經(jīng)節(jié)苷治療恢復(fù)了步態(tài)表現(xiàn)(圖1k)。在MPTP處理的小鼠中，增加了四肢的觸摸和懸掛次數(shù)(圖1l)，和步法模式的數(shù)量(圖1m)。這些行為測試提示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對PD有明顯的治療作用。值得注意的是，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂在三個行為測試中的保護(hù)作用被3-MA（自噬抑制劑）逆轉(zhuǎn)（圖1 a-g和k-m）。這一發(fā)現(xiàn)表明，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的保護(hù)作用可能與自噬有關(guān)。

此外，采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測小鼠紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平。如（圖1h-j）所示，MPTP處理顯著降低了多巴胺、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的水平。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和selegiline治療可防止MPTP誘導(dǎo)的多巴胺、DOPAC和HVA水平減少，提示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂能有效改善多巴胺能神經(jīng)元的功能。

2. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂改善MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，減少神經(jīng)元細(xì)胞中α-Syn的積累

MPTP的代謝物MPP+在體外可導(dǎo)致神經(jīng)毒性。因此，作者進(jìn)一步利用MPP+驗證GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。如（圖2a）所示，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂濃度小于320μM時不引起任何細(xì)胞毒性。MPP+?（1 mM）顯著抑制細(xì)胞增殖，而不同濃度的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂（20、40和80 μM）處理可顯著減弱MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制（圖2b）。此外，MPP+導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，偽足減少，胞體拉長，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂使其恢復(fù)（圖2c）。Western blot分析顯示，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞鐘α-Syn積累（圖2d）。同樣，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂以時間依賴性的方式降低了PC12α-Syn A53T細(xì)胞中的α-Syn過表達(dá)作用（圖2e）。

線粒體功能缺陷和氧化應(yīng)激已在PD的發(fā)病機(jī)制中得到證實。如（圖2g和h）所示，1 mM MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞36 h后，線粒體膜電位(δ ψ m)明顯降低，ROS水平升高，而GM1神經(jīng)節(jié)苷脂治療明顯抑制了這些變化。此外，自噬抑制劑（3-MA或bafilomycin A1）可消除GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的治療效果。這些體外研究結(jié)果與MPTP處理的小鼠的觀察結(jié)果一致，進(jìn)一步提示自噬激活參與了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對PD的保護(hù)作用。

3. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞自噬

已有研究報道GM1神經(jīng)節(jié)苷脂可誘導(dǎo)促進(jìn)多種細(xì)胞系自噬。體外實驗顯示，不同劑量的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理SH-SY5Y細(xì)胞后，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II增加和自噬底物SQSTM1/p62的降解均增強，特別是在40 μM（圖3a）。另外，在該劑量下，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞處理24 h后，這些自噬相關(guān)蛋白的影響最為明顯（圖3b）。為更直觀的觀察GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用，作者使用mRFP-GFP-LC3標(biāo)記進(jìn)行自噬通量測定。Rapamycin（雷帕霉素）通過抑制mTOR[45]發(fā)揮自噬誘導(dǎo)作用，作為陽性對照。由于GFP對低pH條件敏感，當(dāng)自噬小體與溶酶體融合時，GFP(綠色)熒光被熄滅，只能觀察到mRF（紅色）熒光。當(dāng)GFP和mRFP（黃色）熒光同時出現(xiàn)時，說明自噬小體不與溶酶體結(jié)合。與對照組相比，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和Rapamycin處理的細(xì)胞中紅色斑點明顯增多，而GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和bafilomycin A1聯(lián)合處理可增強黃色斑點（圖3c），說明GM1神經(jīng)節(jié)苷脂增強了SHSY5Y細(xì)胞的自噬通量。

4. GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬有助于清除α-Syn

由于去除異常的α-Syn為PD的治療提供了一個很有潛力的策略，早期研究表明自噬介導(dǎo)的α-Syn降解有利于對PD的保護(hù)作用。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對MPTP誘導(dǎo)的小鼠及MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞的保護(hù)作用被3-MA和bafilomycin A1阻斷，說明可能與自噬激活有關(guān)。如預(yù)期的那樣，3-MA顯著消除了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞中α-Syn蛋白水平的影響（圖4a）。作者隨后進(jìn)一步確定GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對自噬過程的影響。數(shù)據(jù)顯示，MPP+存在下，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理明顯促進(jìn)了SH-SY5Y細(xì)胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，同時自噬底物SQSTM1/p62蛋白水平下降（圖4b）。此外，透射電鏡顯示，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理小鼠的黑質(zhì)中存在明顯的自噬泡（圖4c）。重要的是，共聚焦顯微鏡圖像顯示GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)的自噬小體與MPP+誘導(dǎo)的α-Syn共定位（圖4d）。這些體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬，參與α-Syn清除。

此外，作者使用doxycycline誘導(dǎo)α-Syn A53T表達(dá)的PC12α-Syn A53T細(xì)胞，驗證GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對自噬和α-Syn清除的影響。共聚焦顯微鏡結(jié)果（圖5a）顯示，在PC12α-Syn A53T細(xì)胞中，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理后LC3斑點增加，而doxycycline誘導(dǎo)的α-Syn積累減少，其中LC3和α-Syn的共定位顯著增強（圖5a）。Western blot分析證實，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂導(dǎo)致α-Syn蛋白水平下降，而3-MA共處理逆轉(zhuǎn)了這一趨勢（圖5b）。與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂類似，Rapamycin也能強烈降低α-Syn水平（圖5b）。作者采用化學(xué)反應(yīng)方法，用熒光FITC熒光標(biāo)記GM1神經(jīng)節(jié)苷脂。在受GM1-FITC處理的PC12α-Syn A53T細(xì)胞中觀察到強烈的綠色熒光（圖5c）。同時，在PC12α-Syn A53T細(xì)胞中，GM1-FITC和α-Syn以及GM1-FITC和LC3之間觀察到明顯的共定位（圖5d）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GM1神經(jīng)節(jié)苷脂激活自噬來清除α-Syn的積累。

5. ATG13-ULK1復(fù)合物參與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)的自噬

ULK復(fù)合體由ULK1、ATG13、FIP200和ATG101組成，它們是啟動自噬過程所必需的。作者評估了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂對ULK1和ATG13蛋白表達(dá)水平的影響。值得注意的是，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理促進(jìn)了PC12α-Syn A53T細(xì)胞中ATG13和ULK1的磷酸化（圖6a）。然而，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的作用被3-MA抑制（圖6a）。同樣，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂處理的SH-SY5Y細(xì)胞也顯示出p-ATG13/ATG13的比例增加，而3-MA處理抑制了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的這種作用（圖6b）。綜上所述，GM1神經(jīng)節(jié)苷脂通過激活A(yù)TG13-ULK1復(fù)合物來誘導(dǎo)自噬。

總結(jié)

總的來說，作者通過MPTP/MPP+處理建立了α-Syn過表達(dá)模型，以評估GM1在體內(nèi)和體外對PD的治療作用。此外，使用表達(dá)誘導(dǎo)型α-Syn的PC12α-Syn A53T細(xì)胞來證明GM1和α-Syn之間的直接關(guān)系。研究結(jié)果表明，自噬的激活解釋了GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的抗PD作用，并為GM1神經(jīng)節(jié)苷脂清除α-Syn的機(jī)制提供了可能的理論基礎(chǔ)。