![]()
image
Monocle2使用反向圖嵌入（Reversed Graph Embedding）的機器學習算法，來對單細胞RNA-seq數據進行單細胞發育軌跡推斷分析。Monocle2不是通過實驗方法將細胞純化成不同的離散狀態，而是使用一種算法來學習每個細胞在動態生物學過程中經歷的基因表達變化的順序。一旦它了解了基因表達變化的整體“軌跡”，Monocle2就可以將每個細胞分配到發育軌跡中的適當位置中。并且，我們還可以使用Monocle2的差異分析工具來查找在發育軌跡過程中受到調控的基因。如果這個發育過程中存在多個分支結果，Monocle2將重建一個“分支”軌跡。這些不同的分支與細胞的“決策”相對應，Monocle2提供了強大的分析工具來識別受它們影響的基因，并參與這些基因的形成。
在整個生命的發育過程中，細胞會對不同的刺激做出相應的響應，從一種功能“狀態”轉變到另一種功能“狀態”。不同狀態下的細胞會表達不同的基因，產生不同的蛋白質及其代謝產物，從而實現不同功能狀態下的工作。當細胞在不同功能狀態之間轉變時，它們會經歷一個轉錄重新配置的過程，其中一些基因的表達被沉默，而另一些基因則被激活。這些細胞的瞬時狀態通常很難被表征，因為在更穩定的端點狀態之間純化細胞可能是非常困難的或不可能的。單細胞RNA-Seq技術可以使我們在不需要純化細胞的情況下，通過擬時序分析推斷出這些瞬時狀態下的細胞狀態。然而，要做到這一點，我們必須確定每個細胞在可能的狀態范圍內的位置。
細胞排序的工作流程
Trajectory step 1: choose genes that define a cell's progress（選擇用于定義細胞進程的基因）
首先，我們必須選擇用哪些基因去用于后續的細胞排序過程，這個過程稱為特征選擇（feature selection），篩選出的這些基因對后續細胞軌跡的形狀有著最重要的影響。因此，我們應該盡可能的選擇那些最能反映細胞狀態的基因。
這里，我們需要選擇用哪些基因來定義細胞肌發生的進程。我們最終希望能獲得一組基因集，這些基因的表達隨著研究的發育過程的進展而增加（或減少）。篩選用于細胞排序的基因的一種有效方法是，將發育過程開始時收集的細胞與結束時收集的細胞簡單地進行比較，并找到差異表達的基因。
# 使用differentialGeneTest函數進行差異分析
diff_test_res <- differentialGeneTest(HSMM_myo[expressed_genes,],
fullModelFormulaStr = "~Media")
# 提取顯著的差異表達基因
ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))
# 細胞篩選過濾
HSMM_myo <- setOrderingFilter(HSMM_myo, ordering_genes)
# 篩選結果可視化
plot_ordering_genes(HSMM_myo)
上圖中，那些黑色的點對應的基因，即為篩選出的用于后續對細胞進行排序的基因。
Trajectory step 2: reduce data dimensionality（降低數據的維度）
接下來，我們使用reduceDimension函數對篩選出的基因進行數據降維處理，
# 使用reduceDimension函數進行數據降維，并指定method = 'DDRTree'參數使用DDRTree方法
HSMM_myo <- reduceDimension(HSMM_myo, max_components = 2,
method = 'DDRTree')
Trajectory step 3: order cells along the trajectory（根據發育軌跡對細胞進行排序）
最后，對于降維后的數據，我們將使用orderCells函數對細胞按發育軌跡進行排序。
# 使用orderCells函數進行細胞排序
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo)
# 使用plot_cell_trajectory函數對排序的細胞進行可視化
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Hours")
從上圖可以看出，該細胞發育軌跡呈樹狀結構。其中，在0時收集的細胞大多位于樹的頂端之一附近，而其他的則分布在兩個“分支”之間。Monocle2不知道先驗樹的哪個軌跡作為“beginning”，因此我們經常不得不使用
root_state參數再次調用orderCells函數來指定起點。
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "State")
這里我們使用細胞所處的狀態對細胞進行著色。
GM_state <- function(cds){
if (length(unique(pData(cds)$State)) > 1){
T0_counts <- table(pData(cds)$State, pData(cds)$Hours)[,"0"]
return(as.numeric(names(T0_counts)[which
(T0_counts == max(T0_counts))]))
} else {
return (1)
}
}
# 使用root_state參數指定起點
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo, root_state = GM_state(HSMM_myo))
# 根據偽時間對細胞進行著色
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Pseudotime")
# 根據細胞的狀態進行分面展示
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "State") +
facet_wrap(~State, nrow = 1)
如果我們沒有時間序列數據，則可能需要根據已有的生物學知識，利用某些marker標記基因的表達來設置root。例如，在該實驗中，高度增殖的祖細胞群正在產生兩種類型的有絲分裂后細胞。因此，根部應具有表達高水平增殖marker基因的細胞。我們可以使用抖動圖來可視化marker基因的表達，找出marker基因的哪個狀態對應于快速增殖的細胞：
# 選擇marker基因
blast_genes <- row.names(subset(fData(HSMM_myo),
gene_short_name %in% c("CCNB2", "MYOD1", "MYOG")))
# 使用plot_genes_jitter函數可視化marker基因的表達
plot_genes_jitter(HSMM_myo[blast_genes,],
grouping = "State",
min_expr = 0.1)
為了確認細胞排序的準確性，我們可以選擇成肌過程的幾個marker基因，繪制它們的表達在偽時間過程中的變化。
HSMM_expressed_genes <- row.names(subset(fData(HSMM_myo),
num_cells_expressed >= 10))
HSMM_filtered <- HSMM_myo[HSMM_expressed_genes,]
# 篩選marker基因
my_genes <- row.names(subset(fData(HSMM_filtered),
gene_short_name %in% c("CDK1", "MEF2C", "MYH3")))
cds_subset <- HSMM_filtered[my_genes,]
# 使用plot_genes_in_pseudotime函數可視化marker基因的表達
plot_genes_in_pseudotime(cds_subset, color_by = "Hours")
Alternative choices for ordering genes
Ordering based on genes that differ between clusters
我們建議用戶使用通過無監督程序“dpFeature”選擇的基因用于后續的細胞排序。
要使用dpFeature，我們首先篩選出至少在5％的所有細胞中都表達的基因。
HSMM_myo <- detectGenes(HSMM_myo, min_expr = 0.1)
fData(HSMM_myo)$use_for_ordering <- fData(HSMM_myo)$num_cells_expressed > 0.05 * ncol(HSMM_myo)
接下來，我們執行PCA分析，以識別每個PC所能解釋的方差，可以通過繪制碎石圖來查看選擇需要的PC。
plot_pc_variance_explained(HSMM_myo, return_all = F)
然后，我們將那些主要的PC使用t-SNE降維的方法進行降維處理，并將其投影到二維層面進行可視化展示。
# 使用reduceDimension函數進行數據降維
HSMM_myo <- reduceDimension(HSMM_myo,
max_components = 2,
norm_method = 'log',
num_dim = 3,
reduction_method = 'tSNE',
verbose = T)
# 使用clusterCells函數對細胞進行聚類分群
HSMM_myo <- clusterCells(HSMM_myo, verbose = F)
# 使用plot_cell_clusters函數對聚類后的結果進行可視化
plot_cell_clusters(HSMM_myo, color_by = 'as.factor(Cluster)')
plot_cell_clusters(HSMM_myo, color_by = 'as.factor(Hours)')
After we confirm the clustering makes sense, we can then perform differential gene expression test as a way to extract the genes that distinguish them.
# 使用differentialGeneTest函數進行差異表達分析
clustering_DEG_genes <- differentialGeneTest(HSMM_myo[HSMM_expressed_genes,],
fullModelFormulaStr = '~Cluster',
cores = 1)
We will then select the top 1000 significant genes as the ordering genes.
# 選擇top 1000的基因
HSMM_ordering_genes <- row.names(clustering_DEG_genes)[order(clustering_DEG_genes$qval)][1:1000]
HSMM_myo <- setOrderingFilter(HSMM_myo, ordering_genes = HSMM_ordering_genes)
# 數據降維
HSMM_myo <- reduceDimension(HSMM_myo, method = 'DDRTree')
# 細胞排序
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo)
# 設置root狀態
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo, root_state = GM_state(HSMM_myo))
# 排序結果可視化
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Hours")
Selecting genes with high dispersion across cells
變化很大的基因通常對于識別細胞亞群或沿著軌跡排序細胞很有幫助。在單細胞RNA-Seq中，基因的變異通常取決于其均值，因此我們必須謹慎選擇如何根據它們的變化來選擇基因。
disp_table <- dispersionTable(HSMM_myo)
ordering_genes <- subset(disp_table,
mean_expression >= 0.5 &
dispersion_empirical >= 1 * dispersion_fit)$gene_id
Ordering cells using known marker genes
無監督聚類對細胞進行排序是可取的，因為它避免了在分析中引入偏差。但是，無監督的機器學習方法也會存在一定的問題。例如，當我們使用無監督學習時，處于不同細胞周期的細胞會對發育軌跡的形狀產生重大的影響。但是，如果我們希望專注于生物學過程中與細胞周期無關的影響，該怎么辦？Monocle2的“半監督”聚類排序方法可以幫助我們實現相應的處理。
以半監督聚類方式對細胞進行排序非常簡單。首先使用CellTypeHierchy系統定義標記細胞進展的基因，這與我們將其用于細胞類型分類的方式非常相似。然后，使用它來選擇與這些標記共同變化的有序基因。最后，就像我們在無監督的排序中一樣，根據這些基因對細胞進行排序。因此，無監督排序和半監督排序之間的唯一區別是我們使用哪些基因進行排序。
# 選擇marker基因
CCNB2_id <- row.names(subset(fData(HSMM_myo), gene_short_name == "CCNB2"))
MYH3_id <- row.names(subset(fData(HSMM_myo), gene_short_name == "MYH3"))
# 初始化CellTypeHierarchy對象
cth <- newCellTypeHierarchy()
# 根據marker基因的表達標記不同類型的細胞
cth <- addCellType(cth,
"Cycling myoblast",
classify_func = function(x) { x[CCNB2_id,] >= 1 })
cth <- addCellType(cth,
"Myotube",
classify_func = function(x) { x[MYH3_id,] >= 1 })
cth <- addCellType(cth,
"Reserve cell",
classify_func = function(x) { x[MYH3_id,] == 0 & x[CCNB2_id,] == 0 })
# 使用classifyCells函數對細胞進行分類
HSMM_myo <- classifyCells(HSMM_myo, cth)
Now we select the set of genes that co-vary (in either direction) with these two "bellweather" genes:
marker_diff <- markerDiffTable(HSMM_myo[HSMM_expressed_genes,],
cth,
cores = 1)
#semisup_clustering_genes <- row.names(subset(marker_diff, qval < 0.05))
# 選擇top 1000的基因
semisup_clustering_genes <-
row.names(marker_diff)[order(marker_diff$qval)][1:1000]
Using the top 1000 genes for ordering produces a trajectory that's highly similar to the one we obtained with unsupervised methods, but it's a little "cleaner".
HSMM_myo <- setOrderingFilter(HSMM_myo, semisup_clustering_genes)
#plot_ordering_genes(HSMM_myo)
# 數據降維
HSMM_myo <- reduceDimension(HSMM_myo, max_components = 2,
method = 'DDRTree', norm_method = 'log')
# 對細胞進行排序
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo)
HSMM_myo <- orderCells(HSMM_myo, root_state = GM_state(HSMM_myo))
# 細胞排序結果可視化
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "CellType") +
theme(legend.position = "right")
參考來源：http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/
