寫在前面
前日，課題組每周小組會(huì)時(shí)排到我分享論文與研究進(jìn)展。我大體看了下近期植物小RNA相關(guān)研究報(bào)道時(shí)，發(fā)現(xiàn)bioRxiv上，日本Takashi課題組上傳了其所開展的柿子基因組測(cè)序文章。大體掃了一下，我便在課題組組會(huì)上分享。文章題目為《The persimmon genome reveals clues to the evolution of a lineage-specific sex determination system in plants》，文章主題有二：
- 公布柿子基因組測(cè)序結(jié)果
- 闡述柿子性別決定系統(tǒng)的進(jìn)化
研究相關(guān)背景
二倍體柿子雌雄異株。
Takashi組早在2014年，即在science上發(fā)表了柿子性別決定基因的定位與功能鑒定。該報(bào)道主要內(nèi)容為
通過基因定位，確定了柿子上MeGI基因（HB轉(zhuǎn)錄因子）表達(dá)抑制雄蕊發(fā)育，辭成雌花；柿子Y染色體上存在一個(gè)MeGI序列高度相似的非編碼基因OGI，該基因可轉(zhuǎn)錄并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生小RNA并靶向MeGI，從而接觸MeGI對(duì)雄蕊的抑制，最終促成雄花。
大體邏輯即：
雌株：MeGI --| Male
雄株：OGI --| MeGI --| Male, 亦即 OGI --> Male
該工作發(fā)表兩年后，即2016年，Takashi組在The Plant Cell上發(fā)表了六倍體柿子性別決定相關(guān)論文。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控（MeGI）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（OGI）兩個(gè)層次上，增加一個(gè)新的層次，即表觀調(diào)控（甲基化）。其發(fā)現(xiàn)，六倍體柿子的雄性株常常出現(xiàn)雌花。并通過系列分析與測(cè)序，確定是Y染色體的OGI啟動(dòng)子區(qū)間插入了一個(gè)Kali轉(zhuǎn)座子元件。其甲基化程度的變化，影響了OGI的功能實(shí)現(xiàn)。
柿子基因組的測(cè)定
二倍體柿子和六倍體柿子的花性決定系統(tǒng)存在多樣化，但調(diào)控的核心是沒有變化的，即MeGI。Takashi組常年以柿樹為材料，故其開展了該物種的基因組測(cè)定工作。
其通過PacBio測(cè)序，得到contigs，隨后基于F1代簡(jiǎn)化基因組測(cè)序構(gòu)建的遺傳圖譜，掛成15條假染色體。整體上得到單倍型大小約1G的柿子基因組序列。從Circos圖來看，還是挺好看的。【注：簡(jiǎn)單Circos圖繪制，歡迎使用我們課題組開發(fā)的TBtools】
鑒定了柿子獨(dú)立的全基因組復(fù)制事件（WGD）
作者開展物種內(nèi)同源基因的ks值計(jì)算并繪圖。分別比較了葡萄，獼猴桃，番茄和柿子的ks值分布圖。【注：批量ks計(jì)算，一般直接簡(jiǎn)單粗暴地使用NG法，歡迎使用我們課題組開發(fā)的TBtools】
左圖中可以看出葡萄對(duì)應(yīng)的雙子葉植物的古六倍化事件。番茄對(duì)應(yīng)的茄科三倍化。獼猴桃獨(dú)立的兩次WGD事件。柿子也存在近期獨(dú)立的二倍化事件。右圖，作者繪制了4Dtv的分布，進(jìn)一步說明。
確定柿子WGD事件發(fā)生的時(shí)間
作者通過繪制柿子內(nèi)部，柿子與獼猴桃，柿子與葡萄之間的ks值分布。基本確定柿子的WGD時(shí)間發(fā)生在其與獼猴桃分化之后。
同時(shí)，其也基于ks值做了分化時(shí)間推斷，如右圖。
很巧的是，作者提出，柿子的WGD時(shí)間恰恰就發(fā)生在K-pg時(shí)期。
K-pg時(shí)期是很有趣的一個(gè)時(shí)期。不了解的人聽到這個(gè)或許都會(huì)覺得有趣。K-pg時(shí)期，即恐龍大滅絕的時(shí)期。該時(shí)期也發(fā)現(xiàn)了大量植物WGD事件。
WGD產(chǎn)生的基因功能分析
基因復(fù)制，為基因突變提供了原料。基因突變，往往帶來新的基因功能。作者對(duì)WGD產(chǎn)生的大量基因進(jìn)行了dn/ds計(jì)算，同時(shí)也做正選擇分析。
從左圖看出，與預(yù)期相似，僅有極少數(shù)基因存在正選擇（dn/ds>>1）【注：批量dn/ds計(jì)算，一般直接簡(jiǎn)單粗暴地使用NG法，歡迎使用我們課題組開發(fā)的TBtools】。從右圖，作者使用PAML軟件做了分支選擇壓力分析，并發(fā)現(xiàn)WGD產(chǎn)生的基因中，僅有一個(gè)拷貝受到顯著正選擇【注：開展正選擇分析，調(diào)用的是codeML，新手使用難度大，歡迎使用Raindy與我一起開發(fā)的EasyCodeML，界面化操作，免除使用煩惱了和模型參數(shù)困擾】。
有趣的是，作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在少數(shù)幾個(gè)收到強(qiáng)烈正選擇的基因中，赫然出現(xiàn)MeGI (即，其在2014年與2016年發(fā)現(xiàn)的柿子性別決定系統(tǒng)的關(guān)鍵基因)
MeGI與其同源基因的功能分析
如上，作者發(fā)現(xiàn)了MeGI在柿子中存在一個(gè)姐妹基因，如下，MeGI與SiMeGI（Sister MeGI）
MeGI即HB轉(zhuǎn)錄因子家族，其構(gòu)建進(jìn)化樹，并確定了MeGI和SiMeGi的近緣或說復(fù)制關(guān)系。事實(shí)上，MeGI在大麥中的同源基因?yàn)閂ist，該基因控制的是花器官的發(fā)育，與性別分化沒有關(guān)系。
于是，作者提出了猜想：
SiMeGI執(zhí)行的仍然是Vist的功能，而WGD之后柿子獲得了神奇MeGI，并演化出新的功能，促成其雌雄分化。
MeGI與SiMeGI受到不同的選擇壓
與上述方法相似，作者獲取了多個(gè)柿屬物種的MeGI和SiMeGI，并開展了選擇壓力分析【注：歡迎使用EasyCodeML】
其發(fā)現(xiàn)，MeGI分支相對(duì)于SiMeGI和其他物種的HB同源基因分子，受到了顯著正選擇（功能獲得）。同時(shí)，在MeGI和SiMeGI分化后，兩者均處于純化選擇（功能固定化）。
隨后，作者開始了神級(jí)操作。對(duì)MeGI系列同源基因，進(jìn)行滑窗dn/ds計(jì)算。【注：Ziheng Yang，即PAML作者不推薦這個(gè)操作，具體有發(fā)表相關(guān)學(xué)術(shù)論文】
Anyway，作者通過滑窗分析，發(fā)現(xiàn)MeGI分支的5端受到強(qiáng)烈的正選擇，而其他區(qū)域，尤其是HB域（即結(jié)合域）并沒有明顯變化。
其在進(jìn)一步比較MeGI和SiMeGI兩個(gè)分子內(nèi)部的滑窗Dn/Ds分布，發(fā)現(xiàn)，MeGI受到了正選擇的區(qū)域（5端），在于SiMeGI分化后，受到強(qiáng)烈的純化選擇。
MeGI與SiMeGI的基因功能驗(yàn)證
紙上得來終覺淺，分析的結(jié)果往往還是不足以說服別人。作者將MeGI和SiMeGI分別在煙草中進(jìn)行超表達(dá)，并觀察表型。
表型無需解釋，超表達(dá)的MeGI直接影響了雄蕊發(fā)育，從b和e子圖可看出，花粉萌發(fā)率差別顯著。此外，植株長(zhǎng)勢(shì)也有不同。（MeGI畢竟是轉(zhuǎn)錄因子，在柿子中主要是花性別決定時(shí)表達(dá)且作用）
作者對(duì)柿子雌雄花在不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行定量分析，也發(fā)現(xiàn)，只有在雌花中MeGI表達(dá)與SiMeGI有不同的峰。
此外，MeGI事實(shí)上是通過調(diào)控PI基因?qū)崿F(xiàn)功能，于是我們也可以看到SiMeGI并不影響PI表達(dá)。
作者通過DAP-seq，證明了，MeGI的結(jié)合功能確實(shí)沒有變化，與其他HB相同。（進(jìn)一步說明，5端的變化，是其新功能獲得的關(guān)鍵）。
一圖闡述柿屬性別決定系統(tǒng)的進(jìn)化
柿子祖先在分化出來之后，僅僅有SiMeGI。其經(jīng)歷一次WGD后，獲得MeGI。MeGI獲得新功能，抑制雄蕊，促成雌花。在隨后的一次反向復(fù)制后，產(chǎn)生OGI，抑制MeGI功能，解除雄花抑制，促成雄花。
寫在最后
前天在bioRxiv中上傳的文章。整體上看起來是非常不錯(cuò)的工作。也說明了一些問題。從文章使用的分析策略和手段來說，并沒有新的技術(shù)。甚至使用了Tophat等相對(duì)較老的軟件（該軟件作者一度發(fā)表聲明，希望大家不要再用）。此外，大部分進(jìn)化分析使用的是Mega，少數(shù)涉及PAML等。總的來說，作者似乎也與其他課題組開展了合作。這是不錯(cuò)的操作。
文章所闡述的發(fā)現(xiàn)較好，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)也說明了基因的功能。Bingo!相信將會(huì)發(fā)表在不錯(cuò)的期刊上。
植物的性別決定是一個(gè)非常有趣的研究方向。在植物界，僅有約5%的植物是雌雄異株，還有5%左右是雌雄異花同株。這樣占比較小的情況并沒有局限在某個(gè)進(jìn)化分支，而是遍布于不同的科甚至是科下面的部分屬。
性別的分化，主要目的，事實(shí)是實(shí)現(xiàn)雜交，或者說增加物種的多樣性。但是雜交本身是一個(gè)相對(duì)耗費(fèi)能量的事情。一個(gè)物種要快速繁衍，比如擬南芥，自交下一代自交下一代自交下一代，當(dāng)然就很快。只是無限的自交便失去多樣性。有利有弊。或許，性別分化的出現(xiàn)，確實(shí)主要還是應(yīng)為復(fù)雜環(huán)境變化的一個(gè)解吧。
主要參考文獻(xiàn)
