A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19
影響因子： 36.13PMID：32514174期刊年卷：Nat Med 2020 07; 26（7）
醫學一區 細胞生物學 Q1 2/190
DOI：10.1038 / s41591-020-0944-y
COVID-19與外周免疫活性的改變有關，包括可能由一部分炎性單核細胞，淋巴細胞減少和T細胞衰竭產生的促炎細胞因子水平升高。為了闡明在嚴重COVID-19中可能導致免疫病理學或保護性免疫的外周免疫細胞途徑，作者應用了單細胞RNA測序（scRNA-seq）來分析7例因COVID-19住院的患者的外周血單核細胞（PBMC） ，其中四人患有急性呼吸窘迫綜合癥，另外六人健康。作者發現COVID-19中外周免疫細胞表型的變化，包括異源干擾素刺激的基因，HLA II類下調和正在發展的嗜中性粒細胞群體，該群體與發生在需要機械通氣的急性呼吸衰竭患者中出現的漿母細胞密切相關。重要的是，作者發現外周單核細胞和淋巴細胞不表達大量促炎性細胞因子。作者共同提供了對嚴重COVID-19的外周免疫應答的細胞圖譜。
主要結果
七個住院患者用逆轉錄聚合酶鏈式反應8個外周血樣品（RT-PCR）確認SARS-CoV-2感染和6個健康對照組。七名患者均為男性，年齡在20至80歲以上。作者在癥狀發作后2到16天之間收集了樣本；健康對照者無癥狀，4例男性和2例女性，年齡30-50歲（圖1a和擴展數據圖1）。從經診斷患有急性呼吸窘迫綜合征（ARDS；圖1a）的通氣患者中收集八個COVID-19樣本中的四個。對一名患者（C1）進行了兩次采樣：癥狀發作后第9天，僅需補充氧氣，插管后癥狀發作后第11天。三名患者在采樣前的某個時候接受了阿奇霉素，這具有潛在的免疫調節作用13（圖1a）。五名患者在醫院接受瑞姆昔韋治療，其中四名在取樣之前。
圖1：COVID-19患者外周血的成漿細胞擴增和多個固有免疫細胞亞群的消耗
1. 測序總概況
作者對44,721個細胞進行了測序，每個樣品平均測序了3,194個細胞（補充表1）。UMAP確定了30個聚類（圖1b，c）。作者計算了每個簇的最高差異表達（DE）基因，以使用各自的細胞身份手動注釋簇（圖1b，c，補充表2和方法）。表明COVID-19患者與對照之間存在明顯的表型差異，主要存在于單核細胞，T細胞和自然殺傷（NK）細胞中（圖1b，c）。
2. COVID-19驅動的細胞類型比例的變化
接下來，作者量化了COVID-19驅動的細胞類型比例的變化。COVID-19患者的一些先天免疫細胞亞群被耗竭，包括γδT細胞，漿細胞樣樹突狀細胞（pDC），常規樹突狀細胞（DC），CD16 +單核細胞和NK細胞，后三種細胞類型僅在來自ARDS患者的樣本（圖1d）。發燒后或癥狀發作后的時間并不能解釋這些趨勢（S2）。作者還注意到COVID-19患者的成漿細胞比例增加；這些水平在ARDS患者中最高（圖1d），這表明更嚴重的情況下可以用一個更強大的體液免疫應答，類似以前的報告相關聯14，15。來自COVID-19患者的周圍成漿細胞似乎沒有共享特定的免疫球蛋白V基因（圖S3a）。
3. 發現新型細胞
最后，僅在ARDS患者中，作者稱之為“正在發展的嗜中性粒細胞”的新型細胞群才顯著增加（圖1d）。這些細胞表達編碼中性粒細胞顆粒蛋白的幾種基因（例如，ELANE，LTF和MMP8；見圖4和補充表2和3）16，但不表達編碼中性粒細胞標志物的基因，例如FCGR3B和CXCR2（補充表3），并且在UMAP嵌入中占據了與成漿細胞相似的空間，而不是經典的中性粒細胞（圖1c）。此外，它們包含表達細胞CEACAM8，ELANE和LYZ*，類似于最近描述嗜中性粒細胞前體細胞17，18，這表明這些細胞代表在各個發育階段的中性粒細胞。
4. 單核細胞的更多亞群
接下來，作者分析了單細胞的更多亞群，因為在COVID-19患者中，該細胞簇區域似乎最強烈地重塑（圖1b，c）。單核細胞簇區域減小表明CD14 +單核細胞發生了強烈的表型轉移，而CD16 +單核細胞卻在消耗（圖2a，b）。作者首先檢查編碼先前報道通過在COVID-19循環單核細胞產生的炎性細胞因子的基因的表達5，6。值得注意的是，作者沒有發現促炎性細胞因子基因TNF，IL6，IL1B，CCL3，CCL4的大量表達。外周單核細胞產生的CXCL2或CXCL2（圖2c），表明外周單核細胞對COVID-19中的假定細胞因子風暴沒有貢獻。（備注：前一篇文獻中否定了這種說法）
圖2：單核細胞中強烈的HLA II類下調和I型干擾素驅動的炎癥信號是SARS-CoV-2感染的特征
為了確定基因表型驅動重塑COVID-19樣品中，作者確定了DE基因，途徑和上游調節由每個COVID-19樣品的細胞進行比較，以所有健康對照組（圖的細胞2D和補充表格4 - 24）。編碼HLA類II分子8個基因的至少六個COVID-19樣品相對于健康對照組是下調的（圖2d），與其他研究一致19，20。通過表達所有HLA II類編碼基因對單個細胞進行評分顯示，這種下調在所有COVID-19患者中均顯著，但在通氣依賴患者中可能更為明顯（圖2e，f和補充表25）。HLA II類下調反映在差異調節的基因途徑中，包括減少樹突狀細胞與自然殺傷細胞之間的串擾（圖2g和補充表11）。B細胞中也注意到HLA II類下調（擴展數據圖3b，c和補充表10），并且下調的程度在老年患者中趨于更大（擴展數據圖4）。非經典HLA I類基因HLA-E和HLA-F也被下調程度較小且樣品較少，而經典HLA I類基因HLA-A，HLA-BHLA-C和HLA-C并未持續上調或下調（圖2f）。
此外，至少一個COVID-19樣品中的CD14 +單核細胞上調了32種干擾素（IFN）刺激的基因（ISG），但這種IFN信號在所有COVID-19樣品中均不一致（圖2d和補充表4） 。CD14 +單核細胞中上游調節因子的分析顯示，相對于其余COVID-19供體，供體C2，C3和C7中沒有預測的IFN和IFN調節因子（IRF）活性（圖2h）。在其他細胞區室（擴展數據圖中觀察到類似的模式5和6和補充表格18 - 24）。為了對此進行正交分析，作者通過數據集中已知ISG的表達對單個CD14 +單核細胞評分，并再次在供體C2，C3和C7中看到最小的ISG可識別簽名（圖2i和補充表25）。ISG差異的特征不能通過通氣或ARDS來解釋（圖2h，i），但是較高的ISG分數傾向于與年齡呈正相關，而與發燒時間之間呈負相關（圖2j）。
5. COVID-19樣品中的T和NK淋巴細胞
先描述T和NK淋巴細胞存在差異，然后分析差異基因及通路富集分析，最后回歸到表型。
接下來，作者分析了COVID-19樣品中的T和NK淋巴細胞。TMAP和NK細胞的UMAP嵌入確定了CD4 + T，CD8 + T和NK細胞的細胞表型的顯著差異（圖3a，b）。作者發現，CD56dim NK 細胞，一般認為通過細胞介導的細胞毒作用有助于抗病毒宿主防御21，22，是在呼吸機依賴患者的主要消耗殆盡，而CD56bright NK細胞，這被認為是IFN-γ的強大的生產者和腫瘤壞死因子α 23，所有COVID-19樣品中顯著耗盡（圖3c中）。此外，作者鑒定出一群增殖性淋巴細胞細胞，在大多數COVID-19患者中似乎增加（圖3c）。由于SARS-CoV-2感染已與細胞毒性淋巴細胞衰竭有關10，作者通過T細胞和NK細胞分析了編碼經典衰竭標志物的基因的表達。然而，沒有明顯證據表明COVID-19患者的CD8 + T細胞衰竭，盡管CD4 + T細胞中的衰竭標志物似乎升高，但這些變化并不顯著（擴展數據圖7和補充表25）。根據LAG3的表達，大多數COVID-19患者的NK細胞出現衰竭，PDCD1和HAVCR2（圖3d）。類似于作者在外周單核細胞中的觀察，作者沒有檢測到T或NK細胞促炎性細胞因子基因的大量表達（圖3e和圖5和8的擴展數據）；這再次表明，外周血白細胞促炎細胞因子的轉錄不太可能是COVID-19中假定的細胞因子風暴的主要因素。
圖3：在COVID-19中NK細胞衰竭和IFN應答的異質性模式
接下來，作者從相對于健康對照的COVID-19患者的每個樣本中計算了T和NK細胞DE基因，并使用這些基因來鑒定富集的基因途徑和上游調節劑。NK細胞在COVID-19患者之間表現出明顯的異質反應（圖3f和補充表7）。最常見的下調基因包括FCGR3A，AHNAK和FGFBP2，它們與周圍NK細胞成熟度有關24。最常用的上調基因包括的ISG和NK細胞活化基因如PLEK和*CD38 *25，26。作者觀察到CD4 +和CD8 + T細胞中DE基因具有相似的異質性，其中最常見的上調基因是ISG（擴展數據圖5和補充表8和9）。
對預測的上游調節的分析表明，在NK細胞，CD4 +和CD8 + T細胞中，一半的COVID-19分布圖樣本中都沒有明顯的強烈的IFN驅動反應（圖3g，圖5和6的擴展數據以及補充表格21 - 23）。由于干擾素反應的最近的報告說COVID-19在這種反應減弱的重要性，27，28，作者評估ISG上調在不同的細胞類型，以確定是否進行的ISG協調所有細胞類型或個人之間（圖表示3H）。盡管大多數供體在給定的細胞類型（例如CD14 +單核細胞中的IFI27）中某些ISG上調，但通常ISG上調在細胞類型內或受試者之間并不統一（圖3h）。此外，作者發現很少有細胞因子在大多數COVID-19患者之間上調是一致的（圖3i）。這些結果共同表明COVID-19中的異質性外周免疫激活。
接下來，作者分析了漿母細胞和發育中的中性粒細胞的表型，它們似乎與降維在表型上相關（圖1c）。實際上，當僅分析這些細胞類型時，正在發育的嗜中性粒細胞似乎從漿母細胞呈線性投射，表明這兩種細胞類型之間存在連續的細胞表型（圖4a）。在發展中的中性粒細胞中，細胞的復雜性（每個細胞測序的基因數除以每個細胞的唯一分子標識符（UMI））并不高，這使得這些細胞不太可能是多重體（擴展數據，圖9）。）。這些細胞也不太可能代表具有吞噬B細胞的粒細胞，B細胞是吞噬性淋巴細胞組織細胞增多癥（HLH）的特征，可以由嚴重的急性感染觸發，因為這些患者沒有HLH的臨床特征。
圖4：中性粒細胞的發育是重度COVID-19患者的特征，可能與成漿細胞有所區別
全尺寸圖片
6.RNA velocity分析細胞分化軌跡，確定細胞類型改變的原因
為了分析是否有這兩種細胞類型之間的任何過渡，作者通過RNA velocity分析29，30。出乎意料的是，該分析表明細胞表型的線性連續體代表了從漿母細胞到發育中的中性粒細胞的分化橋梁（圖4a）。在所有ARDS患者中均觀察到該成漿細胞-嗜中性粒細胞表型譜，并且該譜與規范中性粒細胞的轉錄動力學無關（圖S10）。沿著這個分化橋的細胞失去了編碼規范性成漿細胞標記CD27，CD38和TNFRSF17的基因的表達，而依次獲得了編碼初級（DEF3A，ELANE和MPO），次級（CHI3DL1，LCN2和LTF）和第三級（MMP8，MMP9和CAMP）中性粒細胞顆粒蛋白，類似于典型的中性粒細胞發育（圖4b）。推斷潛伏時間的恢復（僅基于細胞的轉錄動力學）也暗示了從漿母細胞到發育中性粒細胞的連續性（圖4c）。盡管此連續體開始時的細胞是由Ig基因的表達定義的，但嗜中性粒細胞標志物（如CSF3R和MNDA）（編碼髓核分化抗原）（潛伏時間）上調（圖4d）。
淋巴細胞向粒細胞的分化過程并非沒有先例。類似的轉變已經從B細胞來描述的巨噬細胞或粒細胞，和C /增強子結合蛋白（EBP）轉錄因子家族已經在控制這種轉分化有牽連31，32。兩個C / EBP家庭成員，CEBPE和CEBPD，髓細胞性和粒細胞的兩個已知驅動程序命運33，34，有選擇地通過沿著分化橋（圖細胞的兩個簇表示圖4e中，f）; 從CEBPE到CEBPD的過渡概括了小鼠中性粒細胞的發育35。總的來說，作者觀察到正在發展的嗜中性白細胞種群可能是嚴重COVID-19感染中ARDS的特征。作者的數據表明，這些細胞可能源自漿母細胞，但它們也可能代表來自緊急粒細胞生成的發展中性粒細胞36。
局限性:
作者的樣本量很小，僅對外周血進行了評估，患者的臨床表現時間有所不同，這可能會影響其轉錄情況。
患者用的抗生素阿齊霉素，已經公知的免疫調節活性處理13，而另一子集用的抗病毒remdesivir，其靶向病毒RNA依賴性RNA聚合酶處理37，38并且尚不具有直接的免疫調節作用。
需要進一步的研究以進一步定義在轉錄水平和表型水平上ARDS設置中觀察到的發展中性粒細胞群體的起源和表型。由于粒細胞通常無法在冷凍保存中存活，因此這些研究將最佳地需要重癥COVID-19患者的新鮮全血樣本。
總體而言，作者使用單細胞轉錄組學來表征嚴重COVID-19中的外周免疫反應。作者觀察到ARDS患者中SARS-CoV-2感染的免疫細胞組成和表型顯著變化，以及嚴重COVID-19的免疫學特征。這項工作代表了了解嚴重COVID-19中外周免疫的資源，并為研究COVID-19免疫學和治療發展提供了新的方向。
scRNA-seq計算管道和分析
R軟件包Seurat用于數據縮放，轉換，聚類，降維，差異表達分析和大多數可視化45。對數據進行縮放和轉換，并使用SCTransform（）函數識別可變基因，并進行線性回歸以消除由于細胞復雜性（每個細胞的基因數量，每個細胞的UMI數量）或細胞質量（線粒體百分比）引起的不必要的變異讀取，％rRNA讀取）。使用可變基因進行主成分分析，并使用前50個主成分（PC）進行UMAP，將數據集嵌入二維。
接下來，來構建共享的最近鄰圖（SNN; FindNeighbors（）），并使用基于Louvain方法的基于圖的模塊化優化算法，將該SNN用于對數據集（FindClusters（））進行聚類。用于社區檢測46。盡管對高質量細胞，并在基因回歸上游過濾反光小區質量的，兩個簇被確定，其中65％或正富集基因的100％是線粒體或核糖體來源的，并且這些簇從進一步分析中去除47，48。
Seurat執行Wilcoxon秩和檢驗的發現DE基因對于每個簇（FindMarkers（））和來自前一數據集進行比較的那些標記，以公知的細胞類型特異性基因決定的49，50，51，52，53，54。使用R軟件包SingleR 55確認了簇注釋，該軟件包將每個單個細胞的轉錄組與參考數據集進行比較以確定細胞身份。雖然聚類通常不足以細胞毒性T細胞從NK細胞中分離12，49SingleR將簇0和11中的大多數細胞（分別為94％和76％）識別為NK細胞。實際上，這兩個簇是數據集中唯一顯著富集了NCAM1和FCGR3A的簇（補充表2），因此作者將其標注為NK細胞。作者還觀察到簇22（其中89％的細胞被SingleR注釋為T細胞）富含編碼δδTCR恒定鏈TRGC1，TRGC2和TRDC的基因，因此作者將其注釋為γδT細胞（補充表2）。）。
SingleR將簇24中的大多數細胞標記為常見的髓系祖細胞，但是該簇還包含注釋為造血干細胞和祖細胞的七個不同譜系的細胞。仔細檢查發現，該簇由兩組細胞組成，一組表達CLC，另一組表達CD34，因此作者將其標記為干細胞（SCs）和嗜酸性粒細胞，用于下游分析。總共在簇27細胞的98％是由分揀注釋為髓細胞（46％），前髓細胞（22％），CD34 -前B細胞（14％）或<Q> HSC G-CSF（17％ ）。盡管這些細胞表達了幾個編碼一級，二級和三級中性粒細胞顆粒蛋白的基因（例如，ELANE，MPO，LTF，CTSG，LCN2和MMP8）與第25類（手動標記并由SingleR標記為嗜中性粒細胞）不同，并且不表達像FCGR3B和CXCR2這樣的典型嗜中性粒細胞標記。因為這些細胞在不同的發育階段表現出類似于未成熟中性粒細胞和祖細胞的特征17，18，作者注釋這些細胞為“嗜中性粒發展細胞”。
資料可用性
可從Wellcome Sanger研究所主辦的COVID-19 Cell Atlas（https://www.covid19cellatlas.org/#wilk20）下載帶有去標識的元數據和嵌入的處理后的計數矩陣。Chan Zuckerberg Initiative在https://cellxgene.cziscience.com/d/Single_cell_atlas_of_peripheral_immune_response_to_SARS_CoV_2_infection-25.cxg/上也提供了可處理的數據，供公眾訪問的cellxgene平臺查看和探索。原始測序數據可從NCBI Gene Expression Omnibus（登錄號GSE150728）獲得。可以通過電子郵件將其他材料請求給相應的作者。
代碼可用性
可以從GitHub（https://github.com/ajwilk/2020_Wilk_COVID）獲得用于數據分析的所有腳本。
