我的CRISPR-Cas9基因敲除系列實驗推文好久沒更新了，中間遇到了不少問題，好在都算是一一解決了，細胞在今天早上也已經送出去做測序驗證了，希望能有比較好的結果。今天將會把我整個CRISPR-Cas9實驗的過程以及思路放在這里。
--Part 1 開始前的碎碎念
我從2月28號開始正式做CRISPR-Cas9基因敲除實驗，并不包括前期的sgRNA設計以及引物等待的時間，且本實驗室已有前人構建了較為成熟的CRISPR-Cas9基因編輯系統，因此相關的試劑和耗材沒有耗費我太多的精力，個人認為這一點是非常重要的。對于我而言，這4到5個月的時間是對CRISPR-Cas9從零開始，邊做邊學的一個死磕的過程。很多時候是箭在弦上，不得不發。以下是我遇到的困難總結：
1. 缺乏所有的相關背景知識：這一點在我看張峰老師組的文章的時候，最為明顯。因此花了大量的時間查看中英文文獻以及推文，甚至自己也在總結寫推，即使是這樣，隨著實驗的推進，不知道的東西越來越多，只能兵來將擋水來土掩，這個背景知識的學習過程，任何人都無法代替且非常重要，因為缺乏背景知識，就算有師兄指導，自己也不能很好的吸收。
2. 對整個分子克隆系統的不熟悉：在這之前我從未做過分子克隆相關實驗，例如：載體構建，酶切實驗，質粒轉化、擴增和提取，更別說相關的背景知識了。因此又補充了質粒結構，golden gate還有Gibson assembly等相關知識。可以說在這4個月期間我做得最多的一套操作就是。基因組DNA/質粒提取或者擴增--PCR--切膠回收--酶切跑膠--再次切膠回收--assembly--感受態轉化--挑單克隆擴增--質粒提取，酶切驗證等等。這一系列實驗花費了大量的精力并且大幅占據了實驗記錄本（因為我不僅僅是只做CRISPR-Cas9簡單敲除，還在學習其他基因編輯方法）。
3. 對基因編輯系統的理解：一開始是看張峰老師組的文章，但是各個實驗室在某些步驟上都有自己的偏好和概統。因此當我結束上一個實驗，準備進入下一步的實驗的實驗，師兄說我們不這么做，我們做XXX，然后就懵了。剛開始的感覺就是，當天到底做啥都是在做之前幾個小時或者提前一天才知道，真正的箭在弦上，不得不發。更換實驗步驟和方法，意味著我預先準備的試劑耗材或者說是protocol是用不著的，需要緊急熟悉新的protocol，而且protocol還需要師兄過目（這一點就是有人指導的好處），并且點好關鍵步驟之后才能往下做。
解決困難的辦法：
1. 不抗拒，享受補充背景知識的過程。在這里非常感謝導師能給予非常大的耐心，也感謝師兄給予的指導，雖然他們都看不到我的推啦~先看中文快速熟悉后再看英文，效果會更好。
張峰老師組的文章還有addgene上的poster或者小推文，非常的重要，必學！必要時還可以結合視頻進行理解
2. 厚臉皮，就算被人家說怎么啥也不懂，也不要有心理壓力，畢竟這是真的。有問題查了資料不能解決就問，問到了就好好學，轉化為自己的知識就夠了。今天中午吃飯的時候帶我的師兄第一次夸了我，說你整理得挺清楚的（我今天大匯報），真是激動一臉，感謝師兄DZ。
3. 所有可以用到的資源一個都不放過，因此在早期的時候，果子老師，還有我好友鐵絲、喜糖、大鍋頭等都是被我常常騷擾的，常常大晚上給人家留言問問題，而他們則顯示出了優秀學者嚴謹、細致又認真的習慣和風度，從不同角度給了我指導。不僅是背景知識，甚至在我煩躁的時候還會有一點心理按摩，在大方向上也會給我點明，讓我少走了不少彎路。得嘞，欠你們螺螄粉了。
--Part 2 正文開始
背景知識準備
參考文獻
（1）張峰老師組最全面的CRISPR/Cas9 protocol （我的前期推文已有相應解讀）:
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening
（2）Addgene網站相關poster和推文
（3）中文推文試劑耗材準備
（1）細胞：293T工具細胞，目的細胞，DH5α、stal3感受態細胞（可自行制備，詳見附件protocol）
（2）試劑盒：質粒小提、基因組DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒--均來自天根生物
（3）試劑：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche （推薦），lipofectamine 3000 （life 公司），CloneR，ROCK inhibitor（干細胞相關需要）
（4）質粒準備：常用Cas9-puro質粒
（5）限制性內切酶：實驗室常用限制性內切酶，Golden gate assembly、Gibson assembly相關酶
（6）儀器準備：流式分選，IncuCyte活細胞工作站
（7）軟件準備：Snapgene
流程及目錄
- 確定要敲除的目的基因
- sgRNA設計（詳見文末我的sgRNA設計推文，該推文同時包含PCR引物設計流程），并交由公司合成；需要同時提交PCR引物訂單（見附件protocol-1）
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將sgRNA克隆至Cas9-puro質粒中，并使用酶切驗證（見附件protocol-2，3）
（1）在BbsI酶的作用下，使用golden gate方法將sgRNA克隆到Cas9質粒；
（2）將連接產物轉化感受態細胞，涂平板，過夜培養12-16小時；
（3）挑取單克隆擴增12-16小時；
（4）質粒提取后酶切并瓊脂糖凝膠電泳驗證。 -
將Cas9-puro-gene質粒轉染至293T細胞（24孔板即可），48/72小時后達到>70 %轉染效率
（1）基因組DNA提取；
（2）Q5 PCR（這里的Q5是指NEB公司的高保真DNA聚合酶，詳見附件protocol-4）
（3）凝膠電泳Q5PCR產物，并將目的基因條帶切下，膠回收試劑盒提取DNA條帶（詳見膠回收試劑盒說明書，未附上，需要根據實驗室試劑盒查找）
（4）NEB公司T7 Endonuclease I 酶切驗證是否有基因突變（詳見附件protocol-5）
（5）驗證結果OK后進行正式實驗
將Cas9-puro-gene質粒轉染至目的細胞（普通細胞或腫瘤細胞使用Roche公司轉染試劑集合，干細胞等難轉細胞需要使用特殊試劑或者電轉），參照各轉染試劑說明書即可
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根據轉染效率進行篩選：>70 %，直接種96孔板進行單克隆培養（每個孔只種一顆細胞，注意，需要實時拍照觀察）
如轉染效率非常低，可使用FACS富集后，再進行單克隆培養，大約1-2周后，單克隆成團，將單克隆細胞移至24孔-6孔板擴增。
western blot驗證敲除效率
（1）使用說明書推薦的陽性細胞驗證抗體
（2）WB檢測目的細胞蛋白表達
（3）蛋白表達量太低無法識別時使用免疫熒光檢查
（4）需要注意一些蛋白是在特殊刺激下才有表達，需要預處理方可驗證到，請提前看好文獻驗證成功后
（1）基因組DNA提取
（2）Taq PCR擴增目的條帶，膠回收試劑盒回收目的DNA
（3）目的DNA連接T載體，轉化至感受態細胞，涂平板過夜培養
（4）挑選單克隆、擴增，菌液PCR驗證
（5）提取質粒，送公司測序-
最終結果查看
略
--Part 3 葫蘆
昨晚回去想了想，覺得網絡上詳細的實驗步驟不是沒有，各種學習教程比比皆是，但是零基礎初識CRISPR-Cas9的人怎么樣才能做下來一個實驗。因此，我的教程必須是可以使得零基礎的人跟隨著步驟，結合自己搜索的實驗protocol，一步一步做下來。而去哪里獲取合適的protocol呢？試劑公司的說明書永遠是最好的，在這一整條流程中，各種質粒提取，轉化酶切，都可以查閱到相關說明書，例如：
- 感受態細胞的制備可以簡單的查一查賣這個試劑盒的公司的說明書
- 質粒轉化，可以查閱感受態細胞的說明書
- 質粒提取，膠回收都有相應試劑盒
- 酶切、Q5/Taq PCR、質粒轉染全部都有說明書可循
綜上所述，你差的不是protocol，而是依樣畫葫蘆的葫蘆，而這個葫蘆就是前人的經驗，我沒辦法在這里放太多東西，但是我可以把我每一個關鍵步驟的結果模擬圖附上。根據課題保密需求，只有部分無關緊要內容從我的匯報PPT中拿出來，其余結果圖均從網上獲取整合后以供參考。
實驗1-4 前期準備及預實驗
實驗 5-6
實驗 7-9
望成功
--Part 4 照例放一下前期的推文鏈接
基礎知識系列鏈接（節選）：
CRISPR-Cas9學習筆記
Cre-LoxP條件性基因編輯系統--學習筆記
FLP-FRT系統--誘導性基因編輯inducible gene editing
系列實驗鏈接：
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA設計
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設計好之后
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 4
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 5-15 轉染驗證
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 18 轉染后驗證
CRISPR-Cas9基因敲除實驗步驟 day 25？ 正式實驗
