? ? ? ? 2020年因新型冠狀病毒而顯得異常魔幻，一個我們看不見也摸不到的“小家伙”，把這個世界徹底給攪亂了，如何“看”到它也就成了戰勝它的重要前提。今天，我們將從核酸檢測和蛋白檢測兩個方面給大家介紹新型冠狀病毒的檢測方法和原理，了解人類狙擊病毒的“前哨站”。
1. 新型冠狀病毒簡介
????????新型冠狀病毒屬于冠狀病毒家族。從系統分類來看，屬于套式病毒目（Nidovirales）；冠狀病毒科（Coronaviridae）；冠狀病毒屬（Coronavirus）。它具有囊膜外殼，和單股正鏈RNA的基因組。冠狀病毒只感染脊椎動物，目前發現的能感染人的冠狀病毒有7中，其中包括2003年的SARS-CoV，2012年的MERS-CoV和當前的新型冠狀病毒。2020年1月12日，WHO將其命名為新型冠狀病毒：2019 Novel?Coronavirus （2019-nCoV）；2月11日，國際病毒分類委員會將其命名月SARS-CoV-2（嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒2號，SevereAcute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）（圖1）。
????????2020年2月7日，中國將新冠病毒感染的疾病稱為新型冠狀病毒肺炎，“Novel Coronavirus Pneumonia”，簡稱“NCP”。2020年2月11日，WHO將其稱為新型冠狀病毒疾?。篊oronavirus?Disease 2019，簡稱COVID-19。COVID-19的臨床癥狀有發熱、乏力、呼吸困難等；根據病人影像學尤其是解剖學的分析，COVID-19能造成包括肺，肝臟等在內的多器官損失。
2.新型冠狀病毒的檢測
????????新冠疾病作為一種高傳染性疾病，對其病原體的檢測是診療病人的關鍵。目前檢測傳染病的策略包括兩點，檢測病原體本身，或檢測人體為了抵抗病原體而產生的抗體，也就是病原學檢測和血清學檢測。例如，在冠狀病毒中，針對其刺突糖蛋白，包膜蛋白和核衣殼蛋白的檢測，就屬于病原學檢測中的抗原檢測；而針對其基因組RNA的檢測則是病原學中的核酸檢測。病毒入侵人體，一般會激活機體的特異性免疫，產生抗體進行抵御，針對這些特異抗體的檢測則屬于血清學檢測。
????????這里我們從分子生物學的角度，將上述檢測類型重新分成核酸檢測和蛋白檢測（表1）。不過這里要注意的是，抗原不一定都是抗體，細菌上的脂多糖LPS就不是蛋白。檢測方法上，我們將介紹qPCR、等溫擴增和基于CRISPR的三種核酸檢測技術。蛋白檢測方面則主要講解膠體金法抗體檢測。
3. 核酸檢測
????????目前針對新型冠狀病毒的檢測主要是采用的是qPCR (Real time quantitative PCR, 實時熒光定量PCR）中的Taqman水解探針法。2020年1月21日，中國疾控中心提供的用于新型冠狀病毒核酸檢測的引物和探針序列（圖3）。
3.1 PCR原理
????????在正式介紹實時熒光定量PCR之前，我們先介紹以下PCR原理。PCR （Polymerase?Chain Reaction），即聚合酶鏈式反應，是一種以指數級方式擴增核酸分子的技術（圖4）。一個PCR反應，使用的材料包括：DNA聚合酶，dNTPs，合適的緩沖液，引物以及DNA模板?；旌虾玫腜CR反應體系，在熱循環儀中進行多循環的變性，退火和延伸，即可進行DNA的擴增。在變性階段，高溫將DNA雙鏈打開，然后降溫到退火溫度，引物與DNA互補配對，DNA聚合酶催化新鏈延伸合成，此為一個循環；然后再進行變性，退火，延伸。理論上PCR產物理論上以2N(N是循環數)方式增長。
3.2?實時熒光定量PCR
????????實時熒光定量PCR，是基于熒光物質實時檢測DNA含量的方法。目前主要有使用SYBR Green等的嵌合熒光檢測法和Taqman水解探針法兩種。
????????在嵌合法中使用的SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，檢測熒光強度即可反應dsDNA數量。
? ? ? ? Taqman水解探針法則使用了三條引物，除正常PCR的正反向引物外，還有一條帶熒光標記的探針，其5’端帶有熒光物質（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質（如：TAMRA等）修飾，在探針完整的情況下，由于淬滅基團的存著，熒光物質并不發射熒光。而延伸階段，TaqDNA 聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質發出熒光。通過檢測反應體系中的熒光強度，可以達到檢測PCR 產物擴增量的目的。
????????PCR 產物理論上以2N(N是循環數)方式增長，但實際上，由于酶活、原料消耗等，PCR產物逐漸趨于不變（圖6）。
?? ? ? ? 下面我們介紹qPCR中的“四線三值”。四線：擴增曲線、基線、標準曲線和熔解曲線；三值：閾值、Ct值和Tm值。
????????擴增曲線是指以循環數為橫坐標，熒光強度為縱坐標所作曲線。PCR初始數個循環（通常3-15）的熒光信號，基本不變，接近一條直線，即為基線；實際應用中，基線的取值范圍是可以手動設置的。閾值的默認設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，也可手動設置。Ct值則是指熒光信號達到設定閾值時的循環數。
? ? ? ? 如圖8左所示，使用不同量的DNA作為模板進行qPCR，就可以檢測到每一個量下的Ct值，然后以模板DNA量為橫坐標，所對應Ct值為縱坐標繪制的直線，即為標準曲線。根據這個曲線，我們就可以計算任何Ct值情況下對應的模板量，即可以進行絕對定量。當然，有些時候繪制出來的并不是一條曲線，這可能暗示，所用的引物的擴增效率并不是100%。因此，標準曲線主要用于評估引物的擴增效率和進行絕對定量分析。
????????接下來，介紹的是溶解曲線和Tm值。其中熔解曲線是指隨溫度升高DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線；Tm值則表示總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度。理想情況下，我們針對某一個基因設計的引物，這個引物應該就會很特異；但實際情況卻是，PCR過程中很容易出現沒特異擴增，這樣會造成定量上的不準確。例如圖9中，從擴增曲線圖中，兩對引物的擴增曲線都很正常，但在溶解曲線分析過程中就發現其中一條曲線異常，存在雙峰形式，這提示這一對引物的擴增產物可能有兩種不同大小的片段。
????????前面介紹了SYBR和Taqman兩種qPCR方法，我們小結一下（表2）。
????????我們重新再回到新型冠狀病毒的檢測方法。目前主要是基于熒光探針法，即Taqman的方法?；玖鞒叹褪牵杉∪说难适米印⒈鞘米拥龋缓筮M行病毒滅活，降低感染風險，再進行RNA提取、逆轉錄和qPCR檢測，根據檢測結果判定感染情況（圖10）。
????????當然，在新型冠狀病毒的檢測過程中，出現了較高的假陰性率，這其中的影響因素很多，例如病毒變異，樣品收集處理、試劑耗材質量等等。因此，現在一般是進行至少兩次檢測，以判斷感染情況。
3.3 等溫擴增技術
????????目前，對于新型冠狀病毒的檢測主要是基于Taqman方法進行，一些研究團隊也報道了其他的檢測方法，例如基于等溫擴增檢測。
????????所謂的等溫擴增就是恒定溫度下的核酸體外擴增技術。而前面提到的PCR，則是熱循環核酸體溫擴增技術。等溫擴增對儀器設備的要求低，用恒溫水浴就可以進行，并且反應時間短。目前等溫擴增技術有很多種，例如環介導等溫擴增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，? 依賴核酸序列的擴增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，? 滾環擴增技術(Rolling circle amplification，RCA)，? 單引物等溫擴增技術(Single primer isothermal amplification，SPIA)，? 依賴解旋酶DNA等溫擴增技術(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA)，? 重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，? 鏈替代擴增(Strand displacement amplification，SDA)等。
???? ????這里我們主要介紹其中的環介導等溫擴增。這種方法中最關鍵的是引物設計和具備高鏈置換活性的DNA聚合酶。所謂的鏈置換活性，就是指雙鏈DNA中，新鏈合成的同時將原來的原來的鏈替換下來。
????????LAMP的反應體系與PCR類似，也需要dNTPs，DNA模板，引物等，不過只需要恒定溫度，如65攝氏度，不需要熱循環。對于以RNA為起始的LAMP，則需要先進行逆轉錄合成cDNA。
????????因此，進行新型冠狀病毒的LAMP檢測，同樣需要進行樣品收集，病毒滅活，核酸提取以及擴增等步驟。那么擴增出來的產物又如何監測呢，目前有多種方法進行檢測。
????????首先，我們介紹濁度法，就是觀察反應也混濁度的變化。如果反應體系中出行了擴增，dNTPs就會參入新合成的DNA中，釋放出焦磷酸，而溶液中的Mg2+則可以和焦磷酸反應，產生白色沉淀。如果反應體系中沒有發生擴增，也就不會出行白色沉淀。
????????顏色變化也是LAMP檢測的常用方法，例如金屬離子指示劑——羥基萘酚藍（HNB）。在沒有擴增的情況下，HNB與Mg2+結合，呈現紫羅蘭色；而如果出行擴增，Mg2+因為和焦磷酸反應而與HNB剝離，HNB呈現天藍色。
????????另外還有應用熒光的檢測方法，例如橙綠變色染料（OG Dye）可與LAMP擴增產物結合成明顯的肉眼可見的熒光綠色，陰性反應則為橙色。
????????由于在LAMP擴增中用到很高濃度的引物，因此難免保證有少量錯配和引物二聚體，這些輕微的污染都會導致LAMP高速的擴增中造成假陽性檢測。將LAMP與高特異性的Taqman聯合，提高LAMP的檢測特異性。
3.4基于CRISPR/Cas的核酸檢測
????????在medRxiv和bioRxiv上已經有了基于CRISPR/Cas檢測新型冠狀病毒的報道[4]。目前最為人所知的是CRISPR/Cas9，它可以進行基因編輯。而隨著研究的深入，CRISPR/Cas系統越來越多樣，開發出來靶向雙鏈DNA的CRISPR/Cas12a[5]和靶向RNA的CRISPR/Cas13[6]，這也是目前在核酸檢測中應用最多的系統。
????????其中，張峰等使用CRISPR-Cas13系統開發了SHERLOCK核酸檢測系統，其原理是CRISPR-Cas13a-sgRNA與靶基因（RNA）結合，激活Cas13a的RNase活性[7]；Doudna, J.等則基于CRISPR-Cas12a (Cpf1)-sgRNA與靶基因（DNA）結合，激活Cas12a的ssDNase活性，開發了DETECTR核酸檢測系統[5]。在反應體系中存在sgRNA的靶向DNA或RNA時，可以激活Cas的核酸酶活性，通過降解標記的探針，可以實現對目標核酸的檢測。目前有熒光檢測和側向流檢測試紙兩種形式進行核酸檢測的可視化。
????????在側向流檢測試紙中，使用的是帶生物素和熒光基團的標記探針，一旦探針被降解，熒光集團和生物素就會分開，通過試紙可以檢測到兩條信號帶。熒光檢測則使用了類似Taqman方法中的熒光基團和淬滅基團標記的探針，在探針被降解后，熒光基團和淬滅基團分離，熒光基團的熒光得到恢復，通過儀器可進行檢測。右圖，是張峰實驗室基于SHERLOCK開發的用于檢測新型冠狀病毒的技術[8]。
4. 蛋白檢測
????????目前應用到臨床的核酸檢測方法主要是Taqman實時熒光定量PCR，此外，還有針對抗體IgM和IgG的蛋白檢測方法。接下來，我們簡單介紹相關的蛋檢測技術。
????????首先，我們了解一下免疫、抗原和抗體的相關概念。免疫是機體識別“自己”和“非己”，維持機體穩態的一種生理機制；包括先天性免疫；特異性免疫（體液免疫與細胞免疫）?？乖瓌t是刺激機體產生免疫反應的異己物質；如病毒，外毒素，癌細胞等。抗體（antibody）機體由于抗原的刺激而產生的具有保護作用的蛋白質，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD五種類型; SASR-CoV-2入侵人體后，在細胞中不斷復制積累，可以通過檢測病毒表明特征蛋白表征病毒感染情況；同時，入侵的病毒激活機體特異性免疫，產生IgM和IgG等抗體進行病毒清除。
? ? ? ? 我們最常說的抗體就是IgG，類似于一種“Y”型結構，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。在N端有識別抗原表位的超變區，C端為不變區（Fc）。基于抗體與抗原的特異性識別反應，目前已經開放了一系列免疫檢測方法，最常見的如Western blot；臨床上則多采用膠體金檢測試紙。目前已經有針對新型冠狀病毒特異IgM和IgG的檢測試紙，用于進一步確認病人的感染情況。
????????我們先介紹Western blot。圖示是蛋白質免疫印跡技術的常規流程。我們收集的蛋白質樣品，通過凝膠進行分離后，將凝膠上帶負電蛋白轉移至帶正電的膜上，然后對膜進行封閉處理，再與和目的蛋白質特異結合的抗體進行孵育，這時候抗體會結合在膜上特定的位置，通過一抗與標記抗體（二抗）結合實現對目標蛋白的可視化。?
????????接下來，我們重點介紹針對新型冠狀病毒的IgM/IgG的檢測方法。在新型冠狀病毒感染之后，人體會產生兩種不同的特異性抗體：一種是感染后快速產生的IgM抗體，可作為早期感染指標；另一種是IgG抗體，產生較晚、但維持時間長，在康復期甚至疾病痊愈后都可以被檢測到，是感染和既往感染的重要指標。
????????我們以IgM為例介紹膠體金試紙的原理。這種試紙包括五個功能塊，分別是樣品墊（加樣區），結合墊（含有膠體金標記的抗原），檢測線（還有識別IgM的抗體），質控線（含有抗原特異性識別抗體，類似陽性對照），吸水墊（提供樣品的流向動力）。樣品加在樣品墊上后，樣品逐漸往吸水墊方向流動，在結合墊位置，如果樣品中有特異識別抗原的IgM，就會結合帶膠體金標記的抗原繼續往檢測線方向流動，在檢測線的位置，由于有固定著的識別IgM的抗體，會將低金標抗原-IgM的復合物固定下來，顯示一條“紅線”。而多余的金標抗原則會繼續流動到質控線，被抗原特異的識別抗體結合固定在質控線位置，顯示“紅線”。
????????因此，如果病人被新型冠狀病毒感染，會在質控線和檢測線兩個位置出現“紅線”，否則為陰性或者無效結果。這種檢測方式一般只需要15min。
????????最后，我們總結一下核酸檢測和蛋白檢測。在特異性方面核酸檢測更高，但相應的時間也會比較長。此外，核酸檢測可以在感染的各個時期進行檢測，但蛋白的檢測則比較有局限性，要在感染7天后或是出現癥狀3-4天才能比較準確的反映感染情況。兩種檢測方法，在樣品制備、樣品類型、設備要求以及專業要求和成本上也存在著差異。目前針對新型冠狀病毒的檢測以核酸檢測為主，輔以蛋白檢測。
參考文獻
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