最近幾期的文章介紹了一些輔助分子克隆實驗的小工具，雖然功能很簡單，還是費了很大功夫編寫，最近確實很忙，不過趁周末終于把他們肝完了，本篇就對這些小工具做一個匯總，以暫時結束本系列。
這套工具包括八個子工具，共16個功能模塊，近5000行代碼，主要用于輔助分子克隆實驗設計，希望能對你有所幫助。
工具集網址：http://liuzhen106.com/tools/
1 引物設計
PCR是現代分子生物學領域應用最普遍、最成熟的技術（沒有之一），具有很強的穩健型，因此實踐中似乎怎么隨意的設計引物都能擴增成功，大多數情況下也確實如此。但是，3’錯配、極不對稱的Tm也可能導致PCR失敗，尤其是使用復雜DNA模板時，精心設計的引物能夠提高PCR擴增的成功率。
引物設計是本套工具集中最核心的工具，包括4個功能模塊：克隆PCR、巢式PCR、qPCR(SYBR)、qPCR(Taqman)。設計原理我在之前的文章《PCR引物設計大法》中有詳細介紹，主要考慮Tm、GC%、3’端錯配，3’末端堿基種類等因素，構建一個評分函數，根據得分篩選出最佳引物對。程序化設計使得窮舉大量引物成為可能，相當于把所有的引物組合都拉出來分析一下，這樣就能夠篩選出最佳的引物，因此本工具還是十分有實用價值的。下面分模塊介紹一下他們的特點：
- 克隆PCR
由于必須擴增基因全長序列，就在序列的開頭和末尾把所有18-30bp的引物拉出來，根據?Tm < 3℃這一原則，選出得分最高的引物對。如果基因內部存在重復結構，程序自動示警但也就不再繼續設計引物。在本模塊中你可以正反向引物5’末端添加酶切位點，然后用于后繼的酶切連接，引物以表格方式輸出，點擊復制按鈕可以自動復制引物序列。
- 巢式PCR
巢式PCR是一種提高產物特異性的PCR方法，包括兩輪PCR，第一輪在目標基因之外進行擴增，然后從擴增產物中擴增目標基因。一般適用于目標基因前后GC%不平衡的序列（如植物中的有些啟動子），與其他基因存在同源性的基因等。使用該模塊時，需要同時提供目標基因和一個更大的模板序列，輸出外圍PCR引物和目標基因的克隆引物。
- qPCR(SYBR)
依賴于SYBR染料的qPCR，使用方便、通用性強、價格不高，大眾最愛。這種不需要設計額外的引物，但由于SYBR可以與所有dsDNA結合，容易受非特異性條帶干擾，設計引物時應盡可能考慮特異性，推薦使用NCBI的PrimerBlast工具，它可以在基因組范圍內分析引物的特異性。本模塊未提供該功能，只能在輸入的模板序列中尋找特異性最高的引物，一般輸出200-500bp的靶標基因的引物，這是qPCR(SYBR)最普遍的長度，如果不能滿足你的長度要求，可以使用“克隆PCR”模塊代替。
- qPCR(Taqman)
qPCR(Taqman)除了上下游引物外，還需要一條探針序列，探針設計有特殊的要求，比如5’端第一堿基不能是G，Tm要比上下游引物高8-10℃，3’端不能連續4個G，探針應盡可能靠近上游引物等。本模塊優先設計探針，再根據探針的位置設計上下游引物，可以選擇探針兩端的熒光標記，如果選擇MGB標記，探針Tm會比上下游低5-10℃（MGB具有化學上提高探針特異性的作用）。
2 引物Tm計算
這個工具用于計算DNA引物的退火溫度，傳統的Tm = 2×(A+T)+4×(C+G)公式具有歷史局限性，大量統計學研究已經得到了更準確的Tm預測公式，詳情可查看之前的《PCR退火溫度預測》。
3 核酸?蛋白
核酸與蛋白質序列互轉工具，分為兩個模塊：核酸→蛋白質，蛋白質→核酸。核酸→蛋白質模塊提供將DNA序列翻譯成蛋白質序列的功能，還提供核酸序列的密碼子分析（針對大腸桿菌宿主）。蛋白質→核酸模塊將蛋白質序列轉化為核酸序列，該步驟還提供密碼子優化功能，此外該模塊可以直接分析蛋白質序列的理論分子量、等電點和疏水性。
4 全基因合成
全基因合成是本套工具集中另一個比較核心的工具，其特點是利用59bp以內（普通引物合成的最大長度）的引物基于重疊延伸PCR獲得木目標基因全長。按照引物搭橋的方式不同分為兩個模塊，“一正一反”和“一正多反”，點擊標題欄的“+”按鈕，可以查看對應方法的原理。該工具主要是省去人工一條一條去拉引物和計算重疊區的麻煩，程序保證所有引物間重疊區的Tm基本一致，這有利于各引物間均勻退火。輸出的引物可以直接導入SnapGene軟件進行復核，詳細的設計原理及使用方法可以查看之前的《全基因合成方法》。
5 傳統克隆
適用于傳統的酶切連接克隆，可以選擇單酶切和雙酶切的方式，工具提供插入基因的內部酶切位點分析和引物設計，還提供重組質粒的完整序列生成，可以導入SnapGene進行復核。該工具允許添加一些標簽，其中內置的是一些常用的純化及檢測標簽，他們是可以修改的，你可以換成自己的標簽。
6 Golden Gate克隆
TypeIIS型內切酶切割位點在識別位點之外，因此酶切后識別位點丟失，新插入的片段不會被重新切除，使用TypeIIS型內切酶的克隆方式稱為Golden Gate克隆。同傳統克隆相比，可以酶切連接同時進行，它即省去了DNA純化回收的麻煩，還簡化了實驗步驟，是一種比較受歡迎的克隆方式。TypeIIS存在許多同尾酶，命名多樣，但適合用于Golden Gate克隆主要有六種：AarI、BbsI/BpiI、BspMI/BveI、Eco31I/BsaI、Esp3I/BsmBI、SapI/LguI，本工具支持這六種內切酶。生成插入片段的克隆引物時，成有優先使用切割載體的內切酶，如果基因內部有該酶切位點，程序會自動選擇其他酶切位點，如果你不想使用程序選擇的酶切位點，你可以在序列內部插入該位點，再次生成引物程序會越過該位點使用下一個內切酶。但要注意生成的重組載體序列也會包含認為插入的堿基，你可以在SnapGene中將其去除。
7 簡易克隆
Gibson克隆是Gibson等2009年正式公布的一種DNA組裝方法，一次性可連入多個片段，操作簡單，目前已經十分流行。本工具針對這種克隆方法提供輔助設計，根據線性化載體的方式分為酶切線性化和PCR擴增線性化，外加一個DNA用量計算模塊。
- 限制性酶切線性化
Gibson克隆一般包括：線性載體制備，插入片段制備和片段重組。本模塊適用于單酶切或雙酶切的方式進行載體線性化，查看內切酶按鈕可輸出載體序列中的限制酶位點及數量，選擇對應的限制酶進行酶切即可得到線性載體。允許插入1-5個插入片段，可以選擇同源臂的長度，該長度是對所有片段通用的。
- PCR擴增線性化
該模塊適用于利用PCR擴增的方式獲得線性載體，需要指定插入位點上下游的DNA序列（用于插入片段的位置定位），PCR擴增務必使用高保真酶。
- DNA用量計算
一般，載體與插入片段的摩爾比應該為1:2-1:3，插入片段之間應該為1:1。當插入片段<200bp時，應該顯著增加插入片段的用量1:8-1:10。本模塊將摩爾比換算成納克數，有利于配置重組體系的計算。
8 定點突變
本工具適用于編碼基因的氨基酸突變，根據是否使用新的載體分為使用舊載體和使用新載體兩個模塊。設計原理為根據輸入的突變位點，自動將野生型密碼子替換為突變密碼子，突變密碼子選用大腸桿菌使用頻率最高的同義密碼子。通過突變引物和PCR擴增合成攜帶突變基因局部片段，片段間存在同源區（同源區長度按Tm=52℃來自動控制，這有利于重組反應的退火平衡），可以通過同源重組將突變片段一次性連入載體（相當于多片段Gibson克隆，適用于5個以內的突變片段），也可以通過重疊延伸PCR獲得突變體全長序列后連入載體（相當于單片段Gibson克隆，適用于5個以上的突變片段）。
