無論是Windows，MacOS, Linux桌面的用戶，你都可以也會使用。

寫在前面

伴隨基因組測序的普及，越來越多物種的基因組測序項目開展并報道，為科研工作者提供了更為全面的參考序列信息。目前，單純植物類已公布的基因組，應在400~500個物種之間。這帶來了更多的數據，也帶來了更多的信息分析挑戰。物種基因組公布，往往(至少)會公布兩個文件：

1. 物種基因組序列文件，如 genome.fa
2. 物種序列特征注釋文件【或更常見的 基因結構注釋信息文件】，如 genome.gff3 / genome.gtf

對于具有編程基礎或熟悉 Linux 操作系統的數據分析人員，往往可以通過編寫腳本或使用諸如 gffreads 等命令行工具來進行序列提取【如：所有基因的 CDS 序列】。但對于可以從數據中受益的更多人而言，這并不是一個完美選項。

三年前，TBtools 釋放了 ** GTF/GFF3 Sequences Extract** 功能，應為極少見的【至少我沒見過其他】 可實現基于 GTF/GFF3 注釋信息 從全基因組序列中提取 指定特征序列集合 的GUI工具。

【注，其中 Start 摁鈕為灰色，即不可用，下文有說明】

常見用途

1. 提取所有 CDS 序列集合（可用 TBtools 直接翻譯成 蛋白序列集合）
2. 提取所有 Exon 序列集合（即注釋文件中所有轉錄本序列）
3. 提取所有 Gene 序列結合（即基因的所有Exon和Intron序列）
4. 提取所有 Promoter 序列集合（或為 UTR及上游1~2kb；或為 ATG及上游1~2kb等）

TBtools 提取出的序列可以保證 ID 完全統一，方便后續任何分析【如基因結構可視化，基因定位在染色體上等等】。當然，TBtools 也提供了 GTF/GFF3 信息整理工具，可方便用于直接整理 ID 重命名的映射文件，隨后可用 Fasta Rename 直接進行批量重命名。

以下，大體介紹下兩個常見用途（提取 CDS 或 提取 Promoter）的操作姿勢

使用到的文件

【注：如果文件是.gz .rar .tar.gz 等后綴的壓縮文件，請先解壓縮再使用】

使用第一步

GFF3/GTF文件中存儲的序列特征很多，對于 GUI 操作，用戶往往需要全面了解文件中可供提取的序列特征，如CDS, Exon等。所以使用這一功能的第一步，即 a) 導入GFF3/GTF文件 b) 點擊初始化

可以看到，點擊初始化之后，Feature ID等均有了變化

同時還會彈出一個文本對話框，這個對話框，事實上用戶輔助用戶選擇 Feature Tag 和 Feature ID。

1. Feature Tag，一般是 CDS, Exon, mRNA, Transcript, Gene等，用戶往往已經知道自己要提取什么，不需要輔助
2. Feature ID，以 CDS 和mRNA為例。我們很清楚，真核生物中，大多數基因均是斷裂基因，即 Exon-Intron-Exon... CDS即Exon的部分，所以CDS本身在基因序列的尺度上，也是被 Intron 所分隔。當我們需要提取 CDS 的時候，往往我們說的并不是提取 一截CDS，而是把某個轉錄本對應的幾截甚至幾十截 CDS 按照正確的順序和方向連接起來之后的真實的 CDS 全長。于是 ，如何連接，這個時候，就需要用戶指定一個 ID，如下，

可以看到 GFF3 注釋文件中，同一個轉錄本 ATG01010.1 擁有幾截CDS。這些 CDS 可以以 Parent 這個 Feature ID 來歸組，并組合成 ATG01010.1 的 CDS 全長。事實上，這個文件比較簡單，因為 CDS 并沒有更多的 Feature ID 可以選擇。在其他物種中，常常會出現各種各種的 Feature ID，比如直接是 ID=。
可以看到圖片中還有 mRNA，在這個注釋文件中，每一個mRNA基友 ID= 也有 Parent=，前者事實上是這個 mRNA 獨有的標簽，后者則記錄了這個 mRNA 屬于是哪一個基因的轉錄本之一。此時，如果是要提取這個mRNA的序列【包括Exon和Intron】，那么設置 Feature ID 為 ID 則是正確的。如果選擇 Feature ID 為 Parent，則只會得到不理想的結果。一個基因多個轉錄本會有完全相同的 Parent 便簽，這些轉錄本會按順序串聯起來，這并不沒有生物學意義。

于是，可以開始不同的提取操作了，但是在開始之前，還有一件事情一定不能忘記。

注意事項

TBtools 所有 GUI 功能的設計與使用遵從一個基本邏輯：set [I]nput files，set [O]utput files if needed，click [S]tart button，簡稱 IOS。

所以，下述任何操作，即點擊 Start 之前，先設置輸出文件。

提取物種所有 CDS 序列

很快，可以看到輸出文件。其中包括了物種【注釋文件中包括】的所有CDS序列全長。

如果需要 蛋白序列 集合，那么只需要直接用 TBtools 的 批量翻譯功能即可。

提取所有轉錄本的 Promoter 序列

Promoter 往往指 UTR上游1~2kb 的區間，這并不絕對，因為順式作用元件同樣可以存在于 Intron 甚至是 Exon 上。目前，大多數物種的基因結構注釋信息并不完善，在常見的數據分析中，除少數模式生物，如擬南芥，水稻，人類等，在提及對 Promoter 序列的分析，往往直接使用 翻譯起始密碼子ATG上游1~2kb的序列。此處，也以同樣的方式處理【注，這并不是我本人的生物學認定，僅為演示用】。

于是可以得到，

于是，在所有 CDS 全長的前面，增加了 1000bp 的序列，即上述提及的 Promoter 序列。

很多時候，大家需要的是不包含CDS序列的，純粹的 Promoter 序列，這個時候，只需要勾選多一個選項即可，

于是得到

于是，對于其他序列特征，如Exon全長，miRNA前體等等，參考以上就可以了。

其他參數詳解

這個功能基本完善于兩三年前，但是參數還是比較豐富。

其中：

1. 僅提取不多于指定Feature數目的序列，比如，有時候我們只需要 單外顯子 轉錄本的，那么這個時候，指定最多允許1個Exon即可。
2. 僅提取不少于指定Feature數據的序列，與1. 正好相反
3. 保留注釋信息在輸出的 Fasta 文件 ID，中，有時候我們希望得到信息相對全面的文件
4. 提取 Feature 5’ 端上游指定長度的序列，如上述的 CDS 上游1kb
5. 提取 Feature 3’ 端下游指定長度的序列
6. 只保留上游或下游序列

補充

當然，你可能還有各式各樣的需求。
你只是需要部分基因的Promoter，那就用 TBtools 的 Fasta Extract，

你想要提取GFF3中每個轉錄本對應的基因ID，

你還要想什么？用好搜索框！不用拼命翻菜單。

寫在后面

昨天半夜醒來，毫無困意。推文寫得七七八八，加上前述也聽聞 follower 要在他們的軟件里面實現類似的功能，那么索性推出，方便作為他們的參考。整體上，這個功能自從推出后，幾乎沒有更新過。不過我個人的使用頻次較高，主要原因在于，越多物種的基因組數據要分析，越多項目需要開展，那么 ID 的一致和統一就越顯得重要，而 TBtools 在這塊上從設計之初就很在意。
有時候，我們更多地應該從程序解析或者機械自動化的角度去思考問題，設計和實現功能；而不是純粹考慮輸出結果如何迎合人類偏好。因為，人的欲望是復雜的，甚至是無規律可循。于是，剩下的，就只有斷層。
當然，這也是為什么，很多類似生信小工具很少人愿意去寫，比如 TBtools 的 Fasta 序列操作（包括提取，重命名，格式化等等）。為什么在 TBtools 之前沒有輕便的工具【事實上，除去JRE和一些Wrapper程序，TBtools的整體大小只有幾Mb】?
其實道理就這么簡單，因為簡單而且繁雜的事情，做數據分析/軟件開發方向的絕大多數人，并不在意或者并不愿意，因為這看起來并沒什么技術含量，就跟我現在一直在做的多數工作一樣。
不過，有沒有技術含量，跟值不值得，喜不喜歡，似乎并沒有關系。市面上，又有多少是有技術含量的呢？如果你認真起來。