CLIP-seq結合了實驗和測序方法，可以研究某種蛋白質在體內的RNA的結合情況。原理為基于RNA和RNA結合蛋白在紫外線照射下發生偶聯，再經過蛋白特異性抗體將其沉淀，回收片段，再經添加接頭，PCR擴增，進行高通量測序，最后經過生物信息學方法分析和處理得到相應的結果。本篇文章注重討論后續的生物信息學處理。

這篇文章總結一下如何從測序得到原始數據到質控以及序列匹配和peakcalling等步驟，目的是得到蛋白質及其結合RNA的對應關系。涉及到的軟件有fastx_toolkit（去接頭質控）、bowtie（序列匹配）、samtools（生成bam文件）、bamtools（bam文件排序）、bedtools（bed文件）、piranha（peak_calling）等的使用。

首先討論數據的獲取，通常來源于公共數據庫的下載，或者是實驗所測得。公共數據庫可以從多種途徑上下，諸如ENA，SRA等。我處理的數據全部從SRA上下載。

下載數據我用的是aspera，aspera是一種高速的文件傳輸系統，下載速度和質量都比較好，至于安裝和編譯過程網上均有較詳細的教程。https://asperasoft.com/

（雙端測序文件通常分成不同FTP，所以下載雙端數據需要在文件名加上后綴_1，_2。）

fastx_toolkit: 安裝編譯網上教程均有，功能為去接頭（adaptor），通常需要卡個長度閾值，然后進行質控（這邊保留至少80%得分大于20的序列）。用到的命令有Clipper、Quality filter、Collapser。

clipper 用于減去接頭，通常根據文章特定信息減去接頭，或者根據不同的測序方法減去特定規定的接頭序列（ilumina）主要包括5端接頭和3端接頭。（cutadapt軟件也能去接頭，根據需要選擇）。quality filter用于質量控制，過濾掉質量偏低的序列，collapser用于壓縮相同的序列，壓縮完后fastq文件格式會轉換為fasta格式。

（雙端測序去接頭主要用cutadapt）

bowtie是一款比較強大的比對軟件，比對前通常需要對參考基因組建立一個索引，常用的如hg19的pre-index，bowtie在主頁已經有了，可直接下載使用（3個G左右），然后根據需要設置參數選項等等。bowtie適合比對reads較短的序列，bowtie2適合比對較長的reads（大于1000）.Bowtie: An ultrafast, memory-efficient short read aligner

samtools是一個用于操作sam和bam文件的工具合集，功能較多，這里用來將得到的sam文件抓換為bam文件。bamtools可用來對生成的bam文件進行排序，使其符合一定格式，有利于后續的peak calling，若不執行這一步，則在后續peak calling過程中會報錯，提示你未對bam文件排序。

bedtools是一款及其強大的軟件，具體信息詳見官網介紹，這邊我們先用其bam轉bed，后續還會用到intersect，可以對序列取交集，并根據需要執行不同的輸出。bedtools: a powerful toolset for genome arithmetic — bedtools 2.28.0 documentation

piranha是常用于進行peak calling的軟件，可以通過調整不同的參數，最終能夠得到一部分序列（bed文件）。后續再通過與hg19參考基因組進行取交集，就能得到pc后的序列對應的基因了。