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流式細胞術原理

流式原理

BD LSRFortessa → 流式結果圖

模型

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流式細胞儀的結構與抗原量化過程

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鞘液和樣本在flow cell室中形成層流，使得sample處于軸心

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熒光信號顯示原理

流式圖的顯示一般橫坐標為熒光信號強度，縱坐標為細胞數，對應的一個點為一個細胞。

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流式分選原理

目的是將陽性細胞群單獨分選出來

液滴形成：在流動室下面加一個噴嘴，并使其一定頻率的震動，使液流形成液滴，理想狀態下每四個液體包含一個細胞

如果通過的細胞為陽性表達的細胞，在通過噴嘴后，在一定延遲后（液滴延遲）給與該液滴一個電刺激，使其帶正電荷，在下落的下方電場中偏向一側，最后落到回收管中。

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噴嘴和上樣速度選擇

噴嘴

常見口徑為70，85，100，130um

噴嘴一般大于5倍的細胞大小

tumor：15um

上樣速度：

每Hz的頻率等于每秒通過液滴數

目的是使4個液滴中一個細胞

分選參數

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panel設計

實操

樣本制備

染色流程

1. 檢測細胞膜表面蛋白表達水平

2. 流式檢測胞內IFN-r的操作流程（胞內細胞因子）

3. 流式檢測Treg細胞的操作流程（核內轉錄因子）

note：胞內、核內使用的固定破膜試劑不同

SOP

檢測細胞膜表main蛋白表達水平

1. 取樣：細胞計數，每個Sample去2-5×10^5（根據實驗摸索）個細胞；

2. 染色：細胞離心（300g，5min），棄上清，加入30ul抗體染液重懸細胞；

   Note：常規染色體系30ul即可；細胞離心等待時間可以配置抗體染液；染液配制及細胞清洗均用流式Buffer，即PBS-F（adding 2% FBS）——加FBS目的是減少抗體的非特異性結合，以及增加細胞的存活

染色條件：

Note-01：染色、離心、Buffer均應預冷。

1. 抗體孵育：室溫20℃左右、避光、30min

2. 染死活（可選）：離心后，死活染料重懸細胞；室溫，避光，30min；

   常規實驗，陽性占比比較高&細胞活性不錯，為了減少時間，不加死活；活性不好）腫瘤單懸液，染稀有細胞一定要加死活

3. 清洗兩遍：

   補加入1mlPBS-F，細胞離心；

   棄去上清（不用太干凈，減少細胞損失），用1mlPBS-F重懸細胞，細胞離心；

   棄去上清（不用太干凈，減少細胞損失），用0.5mlPBS-F重懸細胞；

4. 過濾后上機：

   Note:上機前一定要過濾，防止上樣針的堵塞；

   一般用300目的濾網處理（300目=48um，指網孔直徑）

5. 對照

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上機收樣（調電壓）

目的：樣本、單陽管在檢測范圍內且信號和分辨率好

• 未染組-通道在10^2左右（有些調不到，因為自發熒光少，不強求）

• 全染組（陽性對照 OR 全陽可能性最大的組）-小于10^5

• 單陽管-小于10^5 可以調節FSC/SSC，不調熒光電壓即可

使用FlowJo軟件進行數據分析及常見問題

待學習

常用細胞周期流式檢測方法 Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry

DOI:10.21769/BioProtoc.1010328

摘要：細胞周期 (cell cycle) 是指細胞從上一次分裂完成到下一次分裂結束所經歷的全部過程，包括分裂間期和分裂期 (M期)，其中分裂間期又可分為DNA合成前期 (G1期)、DNA合成期 (S期)、DNA合成后期 (G2期)。G0期是靜止期細胞，它們暫時脫離細胞周期，停止細胞分裂，但在一定條件的刺激下，又可重新進入細胞周期進行分裂 (Cooper, 2000)。細胞是生命活動的基本單位，而細胞周期又與細胞的增殖和分化密切相關。因此，對于細胞周期的檢測至關重要。細胞內的DNA含量會隨細胞周期進程而發生周期性變化，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各階段的百分比。常用于測定DNA含量的染料有碘化丙啶 (PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)、7-氨基放線菌素 (7-AAD)、Hoechst 33342、Hoechst 33258等。本文主要就其中兩種常用染料PI (固定細胞染色) 和Hoechst 33342 (活細胞染色) 的實驗方法、注意事項和結果分析展開介紹。

材料與試劑

1. 15 ml離心管 (Falcon, catalog number: 352097)

2. 5 ml流式管 (Falcon, catalog number: 352008)

3. 200目細胞過濾膜

4. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, catalog number: B2261)

5. NaCl

6. Na2HPO4

7. KCl

8. KH2PO4

9. 70%乙醇

10. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)

11. 核糖核酸酶 (Roche, catalog number: 11119915001)

12. 磷酸緩沖液 (1× PBS) (見溶液配方)

13. 碘化丙啶 (PI) 溶液 (見溶液配方)

14. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液 (見溶液配方)

15. Hoechst 33342溶液 (見溶液配方)

儀器設備

1. 渦旋混合器 (其林貝爾, model: VORTEX-6)

2. 水平離心機 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)

3. 光學顯微鏡 (Olympus, model: IX73)

4. 流式細胞儀 (BD FACSFortessa)

實驗步驟

1. 固定細胞PI染色法 (Davies和Allen, 2007)

   1.1

   收集2 × 105細胞，200 × g離心2分鐘，去除上清，并用1 ml 1× PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。

   1.2

   用0.5 ml預冷的70%乙醇重懸固定細胞，在渦旋器上一滴一滴地加入乙醇，4 °C固定30分鐘以上。在醇類固定劑中-20 °C下可以存放幾個星期。

   1.3

   200 × g離心2分鐘，去除乙醇，并用1 ml 1× PBS清洗三次。

   1.4

   用含50 μg/ml PI和200 μg/ml RNase的0.5 ml 1× PBS重懸細胞，37 °C孵育30分鐘。

   1.5

   無需洗滌，樣品過200目細胞過濾膜后轉移至流式管。

   1.6

   上機檢測，用561 nm的激光激發PI，收集610/20 nm波段的發射光，低速上樣，總共記錄20,000個目的細胞。

2. 活細胞Hoechst 33342染色法

   2.1

   收集2 × 105細胞，200 × g離心2分鐘，去除上清，用1 ml 1× PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。

   2.2

   用含10 μg/ml Hoechst 33342的PBS重懸細胞，37 °C孵育30分鐘。 注：Hoechst 最佳濃度和染色時間需要根據具體的每種細胞來確定，一般濃度在5~20 μg/ml，孵育時間為30~120分鐘。

   2.3

   無需洗滌，樣品過200目細胞過濾膜后轉移至流式管，放置冰上。

   2.4

   上機檢測，用355 nm的激光激發Hoechst 33342，收集450/50 nm波段的發射光，低速上樣，總共記錄20,000個目的細胞。

注意事項

1. 一定要做細胞計數，確保細胞數與固定劑量和染料的濃度相匹配。一般來說細胞濃度控制在2 × 105~2 × 106細胞/毫升。

2. 貼壁細胞的消化時間要控制好，消化時間過長，細胞易成團。可邊消化邊觀察。

3. 如果細胞標記熒光蛋白或需要做表面標記，不能使用醇類固定劑，可以使用醛類固定劑。使用醛類固定劑時可以加0.1% Triton X-100。

4. 醇類固定后的樣品可以在-20 °C存放幾個星期，若短時間可置于4 °C避光保存。

5. 上樣速度不宜過快，細胞濃度不宜過高，一般低流速、200個細胞/秒為佳。

結果與分析

細胞周期的分析，以HeLa細胞為例，圖1為固定細胞PI染色法，圖2為活細胞Hoechst 33342染色法。首先用前向 (FSC) 和側向 (SSC) 圈出細胞群，再用熒光通道的W (寬度)/A (面積)去除粘連細胞，最后用熒光通道的柱狀圖分析細胞周期。圖中所標a、b和c分別代表G0/G1期細胞、S期細胞和G2/M期細胞。

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圖1. 固定細胞PI染色法檢測細胞周期

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圖2. 活細胞Hoechst 33342染色法檢測細胞周期

失敗經驗

染料濃度過高或過低或染色時間不夠，都可能導致DNA的四倍體峰無法顯示。

溶液配方

1. 磷酸緩沖液 (1× PBS) NaCl 8 g Na2HPO4 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g 溶于1 L ddH2O中 調整pH值為7.2~7.4，過濾滅菌，4 °C保存

2. 碘化丙啶 (PI) 溶液 2.5 mg PI溶于1 ml ddH2O中，4 °C保存

3. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液 0.5 mg核糖核酸酶溶于0.5 ml 10 mM的Tris-HCl (PH 7.5) 中 100 °C加熱15分鐘 緩緩冷卻至室溫后分裝成小份保存于-20 °C

4. Hoechst 33342溶液 10 mg Hoechst 33342溶于1 ml ddH2O中，4 °C保存

流式細胞術檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI法)

DOI:10.21769/BioProtoc.1010331

摘要：磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine，PS) 又稱復合神經酸，位于正常細胞膜的胞質一側，在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜胞質側翻轉到細胞膜外表面。基于此現象，利用Ca2 +依賴性Annexin V可與PS特異性結合，且親和力高，適用于細胞凋亡早中期的檢測。PI為一種核酸染色劑，與細胞核結合將細胞核染為紅色。PI不可透過正常的細胞膜，可透過凋亡中晚期以及壞死細胞的細胞膜，適用于在排除細胞壞死的前提下細胞凋亡中晚期檢測。將Annexin V與PI同時使用，通過分群表征出正常、壞死、凋亡和機械性損傷的細胞。在該實驗中，我們對HeLa細胞的對照組和H2O2誘導組進行Annexin V/PI雙標記，經流式細胞儀檢測出不同特性的細胞群。

材料與試劑

1. 5 ml流式管 (Falcon，catalog number: 352008)

2. 15 ml離心管 (Falcon，catalog number: 352097)

3. HeLa細胞

4. Annexin V-Alexa Fluor?488 (Invitrogen，catalog number: A13201)

5. PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich，catalog number: P4170)

6. NaCl

7. Na2HPO4

8. KCl

9. KH2PO4

10. H2O2

11. DEME培養基

12. HEPES

13. CaCl2

14. PI染色工作液 (見溶液配方)

15. 1× Binding buffer (見溶液配方)

16. PBS (見溶液配方)

17. 800 μM H2O2 (見溶液配方)

儀器設備

1. 水平離心機 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2. 光學顯微鏡 (Olympus, model: IX73)

3. 流式細胞儀 (FACSFortessa)

實驗步驟

1. 染色前處理

   1.1

   將收集到的細胞，用預冷1× PBS (4 °C) 重懸一次，300 × g , 離心5分鐘，棄上清，收集細胞。

   1.2

   加入300 μl的1× Binding Buffer重懸細胞，調整細胞濃度至1 × 106/ml。

2. Annexin V/PI染色

   2.1

   取流式管，按順序編好空白管，單陽管和樣本管號。流式管中分別加入經200目細胞過濾膜過濾好的100 μl細胞懸液，單陽管中分別加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor?488或10μl PI碘化丙啶輕輕混勻。

   2.2

   樣本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor?488輕輕混勻；再加入10 μl PI碘化丙啶輕輕混勻。

   2.3

   室溫避光孵育10~20分鐘，加入400 μl 1× Binding Buffer，隨后置于冰浴中，上機檢測，所選通道如下： Alexa Fluor?488：488 nm激發，采集波段530/30； PI：561 nm激發，采集波段610/20。

結果與分析

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圖1. 前向 (FSC) 和側向 (SSC) 圈出HeLa細胞

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圖2. Annexin V/PI雙標記HeLa細胞凋亡檢測

如圖1所示通過前向 (FSC) 和側向 (SSC)，分別圈出的對照組和H2O2誘導組的HeLa細胞范圍有所差別。誘導凋亡組的細胞已呈現出分群的趨勢。圖2為Annexin V/PI雙標記的結果，如圖2A所示對照組的HeLa細胞處于正常狀態，但也有少許凋亡晚期的細胞，原因是培養的HeLa細胞濃度過高，導致培養基里的營養消耗過快，少許細胞因饑餓發生凋亡。圖2B中顯示，經H2O2誘導HeLa細胞出現了顯著的早期凋亡現象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的細胞比例呈明顯增長趨勢。綜上可知，雙標記方法可以準確地反映凋亡過程：Annexin V標記的單陽性細胞為凋亡早期細胞；Annexin V 與PI雙標記的雙陽性細胞為凋亡晚期細胞 (Ko?,等，2018)；PI標記的單陽性細胞為壞死細胞；兩者均未標記上的雙陰性細胞為活細胞。由此將凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、壞死細胞與正常細胞區別開。因此，可作為檢測細胞凋亡的首選方法 (Schutte等，1998) 。

注意事項

1. 使用前低速離心，以免液體積存管蓋和管壁。

2. 如果用含EDTA的胰酶消化時，注意必須徹底清除EDTA：在標記前用1× PBS或 1× Binding buffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2+螯合，影響Annexin V的結合。

3. Annexin V-Alexa Fluor?488和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。在處理和標記時，盡可能在暗處進行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后，在暗室內用顯微鏡觀察。

4. 整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4 °C下操作，以免影響細胞狀態。

5. 在細胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會影響實驗結果。

6. 為防止熒光衰變，宜在1小時內進行流式檢測。

7. PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進行Annexin V-Alexa Fluor?488染色，最短可在上機前5分鐘再加入PI染色。

溶液配方

1. PBS NaCl 8 g Na2HPO4 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g 溶于1L ddH2O中，調pH值為7.2~7.4 過濾滅菌 4 °C保存

2. 800 μM H2O2 取30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中，配成20 mM的母液 再取80 μl母液溶于2 ml DEME培養基

3. PI染色工作液 1 mg/mL PI原液+無菌PBS按1:10稀釋成100 μg/ml工作液 4 °C保存待用

4. 1× Binding buffer 10 mM HEPES 140 mM NaCl 2.4 mM CaCl2 pH 7.4

樣本制備