1. Seurat對象查看當(dāng)前的Assay

pbmc <- Read10X('./filtered_gene_bc_matrices/hg19/')
pbmc <- CreateSeuratObject(pbmc,project = 'pbmc3k',min.cells = 3,min.features = 200)
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
pbmc <- NormalizeData(pbmc) %>% FindVariableFeatures(nfeatures = 2000) %>% ScaleData(vars.to.regress = "percent.mt")
pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
DefaultAssay(pbmc)
#[1] "SCT"

在進(jìn)行了SCTransform操作后，矩陣默認(rèn)會變成SCT矩陣，如果不加設(shè)置，后續(xù)的PCA等操作都是基于SCT矩陣。
修改DefaultAssay：

DefaultAssay(pbmc) <- 'RNA'
DefaultAssay(pbmc) 
#[1] "RNA"

2. Seurat使用FindVariables找到高變基因后增刪高變基因

var.gene <- pbmc@assays$RNA@var.features #提取高變基因
pbmc@assays$RNA@var.features <- c(var.gene,c('CD4','CD8'))%>%unique() #增加高變基因
#unique()是為了保證增加的基因不和原有的重復(fù)

3. 不同運行步驟中的文件來源和儲存位置??

• PCA輸入的是@scale.data??
  因為做PCA的前提是：1. 主成分分析認(rèn)為主元之間彼此正交，樣本呈高斯分布；2. 主成分分析假設(shè)源信號間彼此非正交。
  NormalizeData得到的@data矩陣消除了測序文庫差異（對于每個細(xì)胞，將每個基因的count除以總數(shù)，然后乘以一個scale.factor, 之后以自然對數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換），但得到的矩陣仍然是非高斯分布的。而ScaleData對矩陣進(jìn)行了中心化，得到的@scale.data矩陣結(jié)果接近于高斯分布。

• RunTSNE和RunUMAP輸入的都是PCA的數(shù)據(jù)（PCA@cell.embedding），輸出結(jié)果保存在各自的數(shù)據(jù)槽 。

• FindNeighbors輸入的也是PCA的數(shù)據(jù)（根據(jù)PCA降維結(jié)果判斷哪個細(xì)胞和哪個系細(xì)胞距離更近）。這個函數(shù)構(gòu)建SNN矩陣，結(jié)果保存在pbmc@graph下面（輸入的是SCT的PCA得到的是SCT_nn和SCT_snn，輸入RNA的PCA得到RNA_nn和RNA_snn）。

• Harmony讀入的是PCA（要注意是RNA的pca還是SCT的pca）的數(shù)據(jù)，進(jìn)行調(diào)整，在和pca一起保存在reduction下面。其基因數(shù)和PC數(shù)都和PCA一樣。

??：PCA的值是可以被覆蓋的，使用三步法對矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA后再使用SCT矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，PCA的矩陣變成了SCT的PCA矩陣，原有的PCA矩陣不會保留。后續(xù)的TSNE和UMAP降維圖也和三步法不一樣。

• FindClusters輸入的是FindNeighbors的結(jié)果，其運行結(jié)果保存在metadata，使用不同的resolution運行時，每運行一次，meta.data中就會多出一列，記錄不同的resolution的分群結(jié)果。meta.data中的seurat_cluster記錄的是最后一次運行聚類的結(jié)果。

• 細(xì)胞周期評分用的是@data的數(shù)據(jù)??（經(jīng)log轉(zhuǎn)換后的矩陣Normalize Data），運行的結(jié)果儲存在meta.data中

• FindAllMarkers和FindMarkers輸入的是@data的數(shù)據(jù)??

• AverageExpression默認(rèn)輸入的也是@data的數(shù)據(jù)??，但可以通過slot參數(shù)來改，比如設(shè)置slot=‘scale.data’
  延伸閱讀：https://mp.weixin.qq.com/s/s25DLc-tj0lPAcsPurn89Q

• 差異分析和數(shù)據(jù)整合使用的也是@data的數(shù)據(jù)??，雖然官方更推薦使用@scale.data的數(shù)據(jù)，但目前Seurat還不支持。

• FindVariableFeatures()輸入的是@counts的數(shù)據(jù)（??不是Normalized-Data也不是Scaled_Data）
  參考：https://www.biostars.org/p/406388/

FindVariableFeatures()就是在細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行比較，選擇表達(dá)量差別最大的基因，默認(rèn)情況下，會返回2,000個高可變基因。高可變基因的數(shù)目用于做PCA。
Q：PCA輸入的是scale.data的數(shù)據(jù)，scale.data默認(rèn)做的是FindVariableFeatures()找到的高變基因的scale，但是scale.data如果scale了全部基因，做PCA也就是用的全部基因，那FindVariableFeatures()還有什么用？
A：雖然很多教程都提示內(nèi)存足夠的話建議scale所有的基因，但PCA的時候還是要選擇高變基因，否則會引入噪聲。低豐度，變化低的基因，很多都是噪音，如果用全部基因去跑PCA，這種低豐度基因的噪音是沒有辦法通過選擇pc數(shù)去除的。仔細(xì)看Seurat官網(wǎng)，雖然它推薦scale全部基因，但是做PCA的時候還是限定了使用高變基因。

https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html

此外如果使用了SCTransform，默認(rèn)是得到3000個高變基因，Scale的也是高變基因。再下一步直接做RunPCA()，也是默認(rèn)使用高變基因。

4. @data標(biāo)準(zhǔn)化矩陣和@scale.data 歸一化矩陣的區(qū)別
單細(xì)胞RNA 測序數(shù)據(jù)中，文庫之間測序覆蓋率的系統(tǒng)差異通常是由細(xì)胞間的cDNA 捕獲或PCR 擴增效率方面的技術(shù)差異引起的，這歸因于用最少的起始材料難以實現(xiàn)一致的文庫制備。標(biāo)準(zhǔn)化旨在消除這些差異（例如長度，GC 含量），以使它們不干擾細(xì)胞之間表達(dá)譜的比較。這樣可以確保在細(xì)胞群體中觀察到的任何異質(zhì)性或差異表達(dá)都是由生物學(xué)而不是技術(shù)偏倚引起的（批次矯正僅在批次之間發(fā)生，并且必須同時考慮技術(shù)偏差和生物學(xué)差異，標(biāo)準(zhǔn)化只需考慮技術(shù)差異）。
軟件Seurat 提供了三種標(biāo)準(zhǔn)化的方法，分別為LogNormalize、CLR、RC，通常情況下我們采用LogNormalize 的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計算公式為：log1p((Feature counts/total counts) ? scale. factor)

歸一化的目的則是使特征具有相同的度量尺度

參考：Seurat的normalization和scaling

5. 關(guān)于有些細(xì)胞屬于同一個cluster但是在umap或者tsne圖上相聚較遠(yuǎn)的問題：UMAP和TSNE是各自的算法在PCA降維的基礎(chǔ)上再進(jìn)行非線形降維，在二維圖上把其各自算法認(rèn)為相近的細(xì)胞聚在一起。但是FindClusters輸入的不是UMAP或TSNE降維的數(shù)據(jù)，而是FindNeighbors的數(shù)據(jù)，而FindNeighbors輸入的數(shù)據(jù)是PCA降維數(shù)據(jù)，是用另外一種算法計算的細(xì)胞之間的距離。因此會出現(xiàn)有些細(xì)胞被認(rèn)為是同一個cluster，但是在umap或者tsne圖上相聚較遠(yuǎn)（尤其是一些散在的，脫離主群的細(xì)胞）

6. marker基因鑒定，查看marker基因的表達(dá)是使用RNA矩陣還是sct矩陣？
這是一個爭議性問題，兩個都可以，目前建議最好使用RNA矩陣。
sct的到的count并不是真實的基因表達(dá)值，而是通過scaledata倒推出來的，它是一個回歸，運算之后的殘差。

7. 關(guān)于FindAllMarks找到的基因
如下圖，先看cluster0的Marker基因：cluster0的差異基因是cluster0的細(xì)胞和剩下的所有的cluster合在一起的細(xì)胞做對比得到的。pct.1是這個基因在cluster0中的表達(dá)比例（S100A8在cluster0的細(xì)胞中的表達(dá)比例是100%），pct.2是這個基因在除了cluster0以外的所有細(xì)胞中的表達(dá)比例（S100A8在除cluster0以外的細(xì)胞中的表達(dá)比例是51.2%）。avg_log2FC是表達(dá)差異倍數(shù)，p_val_adj是校正后的p值。

8. 在提取Marker基因時比較好的辦法：因為單細(xì)胞矩陣算出來的結(jié)果，p_val_adj==0的有很多，所以可以先把p_val_adj==0先提出來。再把p_val_adj<0.01的按差異倍數(shù)靠前的20/30/500...（按需要）個基因提出來，然后把兩個矩陣合在一起（取交集）用來做細(xì)胞鑒定。（結(jié)合p值和fc來做篩選效果更好）

top = 30   #可根據(jù)需要調(diào)整
TopMarkers1 <- ClusterMarker %>% filter(p_val_adj == 0) %>% group_by(cluster) %>% 
  top_n(n = top, wt = avg_log2FC)
TopMarkers2 <- ClusterMarker %>% filter(p_val_adj < 0.01) %>% group_by(cluster) %>%
  top_n(n = top, wt = avg_log2FC)
TopMarkers <- rbind(TopMarkers1, TopMarkers2) %>% unique.matrix() %>% arrange(cluster)
write.csv(TopMarkers,'CellType/TopMarkers.csv', row.names=F)

??：提取沒有核糖體和線粒體的marker基因更好。（這些基因?qū)﹁b定沒有幫助）

人的核糖體基因是RPS/RPL開頭
人的線粒體基因是MT-開頭
小鼠的核糖體基因是Rps/Rpl開頭
小鼠的線粒體基因是mt-開頭

##人
### 提取沒有線粒體、核糖體的Markers
ClusterMarker_noRibo <- ClusterMarker[!grepl("^RP[SL]", ClusterMarker$gene, ignore.case = F),]
ClusterMarker_noRibo_noMito <- ClusterMarker_noRibo[!grepl("^MT-", ClusterMarker_noRibo$gene, ignore.case = F),]
top = 100   #可根據(jù)需要調(diào)整
TopMarkers1 <- ClusterMarker_noRibo_noMito %>% filter(p_val_adj == 0) %>% 
  group_by(cluster) %>% top_n(n = top, wt = avg_log2FC)
TopMarkers2 <- ClusterMarker_noRibo_noMito %>% filter(p_val_adj < 0.01) %>% 
  group_by(cluster) %>% top_n(n = top, wt = avg_log2FC)
ClusterMarker_noRibo_noMito <- rbind(TopMarkers1, TopMarkers2) %>% unique.matrix() %>% arrange(cluster)
write.csv(ClusterMarker_noRibo_noMito,'CellType/TopMarkers_noRibo_noMito.csv', row.names=F)

##小鼠
### 提取沒有線粒體、核糖體的Markers
ClusterMarker_noRibo <- ClusterMarker[!grepl("^Rp[sl]", ClusterMarker$gene, ignore.case = F),]
ClusterMarker_noRibo_noMito <- ClusterMarker_noRibo[!grepl("^mt-", ClusterMarker_noRibo$gene, ignore.case = F),]

有些基因比如Foxp3，對細(xì)胞鑒定很重要，但常常在篩選Marker基因的時候篩選不出來。非負(fù)矩陣分解可能更好。
參考：過濾線粒體核糖體基因

9. 提取亞群

Idents(pbmc) <- "celltype" #先把celltype設(shè)成Idents（active ident)
CD4T <- subset(pbmc, idents = "CD4_T") #通過idents來提取
tmp <- c("orig.ident", "percent.mt","percent.rb","percent.HB","S.Score",
         "G2M.Score","Phase","DF.classifications")
CD4T <- CreateSeuratObject(CD4T@assays$RNA@counts, meta.data = CD4T@meta.data[,tmp])
#metadata保留了，降維聚類結(jié)果沒有保留

??新提取的亞群需要重新進(jìn)行降維聚類（和大群相比，標(biāo)記基因發(fā)生了變化），并重新尋找marker基因，重新分群，注釋。??subset提取子集后，不同樣本間批次校正的信息也被去除，需要重新進(jìn)行批次矯正

參考：Seurat取子集時會用到的函數(shù)和方法??????

10. 取子集后如何去除空子集（還存在這個level，但里面包含的細(xì)胞為0，如何去除）as.factor(as.character())

Idents(CD4T) <- "seurat_clusters"
CD4T.sub <- subset(CD4T, idents = c(0,1,2,3,4,5,6))
CD4T.sub$seurat_clusters <- as.factor(as.character(CD4T.sub$seurat_clusters))
CD4T.sub$celltype <- as.factor(as.character(CD4T.sub$celltype))
saveRDS(CD4T.sub, "CD4T/CD4T.classified.rds")

11. 雙細(xì)胞的預(yù)測和去除如DoubletFinder建議單樣本進(jìn)行，不建議雙樣本一起預(yù)測。除此之外，其他步驟都可以多樣本一起做，質(zhì)控的時候也可以多樣本一起做，但是建議每個樣本都單獨看一看。

12. 單細(xì)胞多樣本整合：merge()；多樣本拆分：SplitObject()

scRNA <- merge(scRNAlist[[1]], scRNAlist[2:length(scRNAlist)])
scRNAlist <- SplitObject(scRNA, split.by = "orig.ident")

13. 在做多組數(shù)據(jù)整合，每個組又有多個樣本的時候，最好把單獨的每個樣本當(dāng)成批次，而不是把不同的組當(dāng)成批次。

14. 多核運算

library(future)
options(future.globals.maxSize = 20 * 1024^3)
plan(multisession, workers = 8) #開啟多核運算 (8個核)

plan('sequential') #終止多核運算

參考：單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中future包的使用

15. pbmc3k.final@commands$FindClusters 可以查看FindClusters運行時間和記錄。Seurat是記錄其分析過程的，也可查看command下其他操作

16. 關(guān)于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：同一組織的最好用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，不同組織的可以不一樣。不同組織線粒體含量等可能存在差異。

17. 可視化的方法總結(jié)
參考：http://www.lxweimin.com/p/0d1e2c7d21a4

18. circos圖繪制

19. 單細(xì)胞數(shù)據(jù)思維導(dǎo)圖，有利于查看單細(xì)胞數(shù)據(jù)格式。
http://www.lxweimin.com/p/7560f4fd0d77

20. 對于舊版本Seurat對象的更新
scRNA <- UpdateSeuratObject(scRNA)
UpdateSeuratObject {SeuratObject} ：Update old Seurat object to accommodate new features

21. 對有些操作需要用到python設(shè)置的情況

Sys.setenv(RETICULATE_PYTHON="/usr/bin/python3")
# ??要根據(jù)自己python3的路徑來設(shè)置，可以在終端使用which python3來查看 

22. 單細(xì)胞數(shù)據(jù)做pooling的好處：可以盡量的降低dropout的問題。（dropout就是矩陣中的zero，這些zero實際上并不是0，而是每個液滴里面起始反應(yīng)量太低了。而一般的反轉(zhuǎn)錄效率只能到30%左右，70%的轉(zhuǎn)錄本實際上在反轉(zhuǎn)錄那一步是被丟掉的，這是單細(xì)胞測序一個比較大的問題）。
但是一旦做了pooling，你必須要證明pooling對結(jié)果是沒有影響的（下圖的右面三個圖）。

這個文章用了pooling

23. Seurat的VlnPlot中的combine參數(shù)，在如下畫三個基因的情況下，設(shè)置成T就畫一張圖，設(shè)置成False，會將三個基因各畫一張圖。

VlnPlot(seuratObj, features = c("Il15", "Cxcl10","Cxcl16"), split.by = "aggregate", pt.size = 0, combine = T)

24. rev()這一步是將橫坐標(biāo)的基因反過來排序

DotPlot(scRNA, features = nichenet_output$top_ligands, cols = "RdYlBu") + RotatedAxis()
DotPlot(seuratObj, features = nichenet_output$top_ligands %>% rev(), cols = "RdYlBu") + RotatedAxis()

這兩個畫出來的圖橫坐標(biāo)基因的順序是相反的（見NicheNet）

25. 堆疊小提琴圖的繪制
完成這個需求有以下幾種實現(xiàn)方法：
1. Seurat包直接就可以實現(xiàn)（stack = T）
2. 通過Seuart->scanpy來實現(xiàn)，第一張是Seurat包VlnPlot函數(shù)畫的圖，第二張是scanpy中stacked_violin函數(shù)畫的圖，那么現(xiàn)在問題就變成為Seurat對象到scanpy對象的轉(zhuǎn)換
3. 用R原生函數(shù)實現(xiàn)StackedVlnPlot的方法
4. 使用基于scanpy包衍生的scanyuan包來說實現(xiàn)
5. 使用R包MySeuratWrappers來實現(xiàn)

最簡單的方法1如下：

pbmc = readRDS('pbmc.rds')
markers <- c('CD14','CD68','CD4','CD19','MS4A1','CD79A','GNLY','NKG7','GZMB','CD8A','CD8B','FCGR3A',
             'FOXP3','PPBP','FCER1A','CD34')
markers <- CaseMatch(markers, rownames(pbmc))
markers <- as.character(markers)
VlnPlot(pbmc, features = markers, pt.size = 0, group.by = 'cell_type',stack = T)+NoLegend()

26. 當(dāng)繪圖需要設(shè)置橫坐標(biāo)順序時，先把Ident設(shè)置為需要繪圖的變量，再使用factor進(jìn)行設(shè)置。

Idents(scRNA) <- 'orig.ident'
My_levels <- c( "con1","con2", "con3", "case1","case2", "case3")
Idents(scRNA) <- factor(Idents(scRNA), levels= My_levels)

如果不設(shè)置level，會按字母順序排列，case會自動排在con前面。

27. 在繪制多個質(zhì)控參數(shù)的小提琴圖時，可以先生成一個空list，將每張圖都存成list的一個對象，再使用patchwork包的wrap_plots函數(shù)畫成一張圖。

plot.featrures = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt", "percent.HB")
plots = list()
for(i in seq_along(plot.featrures)){
    plots[[i]] = VlnPlot(scRNA, pt.size = 0,
                         features = plot.featrures[i],log = T) + theme.set2 + NoLegend()}
wrap_plots(plots = plots, nrow=2) 
ggsave(filename = 'beforeQC9log.pdf', width = 8, height = 6)

28. 在進(jìn)行細(xì)胞注釋時，可以使用recode函數(shù)

scRNA$celltype <- scRNA$SCT_snn_res.0.3
scRNA$celltype <- recode(scRNA$celltype,
                         "0" = "CD14_Monocyte",
                         "1" = "CD14_Monocyte",
                         "2" = "NK_cell",
                         "3" = "B_cell",
                         "4" = "T_cell",
                         "5" = "T_cell",
                         "6" = "CD16_Monocyte",
                         "7" = "Megakaryocyte",
                         "8" = "NK_cell",
                         "9" = "T_cell",
                         "10" = "T_cell",
                         "11" = "T_cell",
                         "12" = "T_cell",
                         "13" = "T_cell",
                         "14" = "B_cell",
                         "15" = "DC",
                         "16" = "Neutrophil",
                         "17" = "T_cell",
                         "18" = "Proliferating_lymphocyte",
                         "19" = "CD14_Monocyte",
                         "20" = "B_cell")

29. 對某一metadata進(jìn)行重命名

#查看meta.data中有哪些內(nèi)容
colnames(scRNA@meta.data) 
#meta.data中第13個進(jìn)行重命名
colnames(scRNA@meta.data)[13] <- 'Cytokine_Score' 

使用Seurat的RenameIdents函數(shù)也可以

scRNA <- RenameIdents(scRNA, 'oldIdent'='newIdent')

30. 進(jìn)行marker基因繪圖時，使用CaseMatch函數(shù)去除不存在的基因。

markers <- c('CD79A','CD79B','MS4A1','CD19','MZB1','GNLY','NKG7','NCAM1','CD3D','CD3E')
markers <- CaseMatch(markers, rownames(scRNA))
markers <- as.character(markers)

31. prop.table函數(shù)，生成細(xì)胞比例表格，用于繪制細(xì)胞比例條形圖

prop.table(x, margin = NULL)

x: table
margin: a vector giving the margins to split by. E.g., for a matrix 1 indicates rows, 2 indicates columns, c(1, 2) indicates rows and columns. When x has named dimnames, it can be a character vector selecting dimension names.

m <- matrix(1:4, 2)
m
#      [,1] [,2]
# [1,]    1    3
# [2,]    2    4
proportions(m, 1)
#           [,1]      [,2]
# [1,] 0.2500000 0.7500000
# [2,] 0.3333333 0.6666667

#根據(jù)orig.ident來計算細(xì)胞百分比
cell.prop<-as.data.frame(prop.table(table(Idents(scRNA), scRNA$orig.ident)))
colnames(cell.prop)<-c("cluster","Group","proportion")
write.csv(cell.prop,row.names = FALSE,file = 'cell_prop_all.csv')
cell.prop$Group <- factor(cell.prop$Group,ordered=TRUE,levels=c("HC1","HC2","HC3","Case1","Case2","Case3"))
ggplot(cell.prop,aes(Group,proportion,fill=cluster))+
geom_bar(stat="identity",position="fill")+
  ggtitle("")+
  theme_bw()+
  theme(axis.ticks.length=unit(0.5,'cm'))+
  guides(fill=guide_legend(title=NULL))
ggsave(
  'NK/satck_prop_NK.pdf',
  plot = last_plot(),
  device = NULL,
  path = NULL,
  scale = 1,
  width = 10,
  height = 8,
  dpi = 300,
  limitsize = TRUE,
)

32. 在從基因表達(dá)矩陣（行為基因，列為樣本）直接生成Seurat對象時，如下：

HC_1 <- CreateSeuratObject(counts = HC_1)

得到的HC_1樣本的orig.ident默認(rèn)是樣本名中第一個_號的前一部分。所以要保證矩陣的列名是樣本名_細(xì)胞barcode這樣的格式。
如果有多個分組，例如兩個樣本矩陣中細(xì)胞分別命名為HC_1_barcode，HC_2_barcode，在直接通過如下方法得到兩個Seurat對象，再對其進(jìn)行merge之后，兩個樣本會被合并成一個。也就是樣本信息只保留了第一個_號之前的HC，沒有保留_號之后的1和2。

HC_1 <- CreateSeuratObject(counts = HC_1)
HC_2 <- CreateSeuratObject(counts = HC_2)
scRNA <- merge(HC_1,HC_2)
table(scRNA$orig.ident)
# HC
#3000

為了避免這種情況，可以在構(gòu)建Seurat對象時通過參數(shù)進(jìn)行設(shè)置

HC_1 <- CreateSeuratObject(counts = HC_1,names.field = 1:2)
HC_2 <- CreateSeuratObject(counts = HC_2,names.field = 1:2)
scRNA <- merge(HC_1,HC_2)
table(scRNA$orig.ident)
# HC_1  HC_2 
# 1500  1500

33. 在做umap和tsne的時候有很多聚不在一起的小群，可以考慮下面幾種情況
    (1) 雙細(xì)胞的問題
    雙細(xì)胞傾向于獨立成群，或位于大群的邊緣或線狀連接部分。
    (2) 高變基因數(shù)目選擇問題
    FindVariableFeatures()時nfeatures選的越多，圖越分散
    (3) 降維時pc數(shù)目的選擇
    做tsne和umap降維時選擇的pc數(shù)越多，圖越分散。
    參考：如何確定細(xì)胞聚類的PC數(shù)

??PC數(shù)的選擇：Seurat官網(wǎng)提供的三種方法只能給出PC數(shù)的粗略范圍，選擇不同PC數(shù)目，細(xì)胞聚類效果差別較大，因此，需要一個更具體的PC數(shù)目。作者提出一個確定PC閾值的三個標(biāo)準(zhǔn)：

# Determine percent of variation associated with each PC
pct <- pbmc [["pca"]]@stdev / sum( pbmc [["pca"]]@stdev) * 100
# Calculate cumulative percents for each PC
cumu <- cumsum(pct)
# Determine which PC exhibits cumulative percent greater than 90% and % variation associated with the PC as less than 5
co1 <- which(cumu > 90 & pct < 5)[1]
co1
# Determine the difference between variation of PC and subsequent PC
co2 <- sort(which((pct[1:length(pct) - 1] - pct[2:length(pct)]) > 0.1), decreasing = T)[1] + 1
# last point where change of % of variation is more than 0.1%.
co2
# Minimum of the two calculation
pcs <- min(co1, co2)
pcs
# Create a dataframe with values
plot_df <- data.frame(pct = pct,   cumu = cumu,   rank = 1:length(pct))
# Elbow plot to visualize 
ggplot(plot_df, aes(cumu, pct, label = rank, color = rank > pcs)) + 
  geom_text() + 
  geom_vline(xintercept = 90, color = "grey") + 
  geom_hline(yintercept = min(pct[pct > 5]), color = "grey") +
  theme_bw()

34. 亞群注釋注意事項

一般先選默認(rèn)分辨率(0.8)，大概可能會分出十幾個群。因為最終都是要注釋到每一個barcode，所以首先可以看大類marker的分布(不受分辨率影響)，可以根據(jù)marker基因的分布來調(diào)整分辨率。是否需要精細(xì)的分群得看精細(xì)的分群對研究有沒有決定作用，還有很重要的一點是看分出的各個cluster在Findallmarkers給出的結(jié)果中marker的熱圖是不是能明顯分開。精細(xì)劃分的細(xì)胞本來就很類似，如果有部分小群的熱圖明顯分不開或者非常類似，就可以考慮把分辨率調(diào)小。

比如像這種情況，3和4可能就是同一類細(xì)胞

35. 跑umap/tsne跟跑FindNeighbors輸入的都是PCA的矩陣，但是用的pc數(shù)可以是不一樣的。
    在一些教程里面，我們常常看到這樣的代碼，在看了一下ElbowPlot之后選定了PC數(shù)就直接RunTSNE，RunUMAP和FindNeighbors都用一樣的pc數(shù)。

pbmc <- RunPCA(pbmc, verbose = F)
ElbowPlot(pbmc, ndims = 50)
pc.num=1:20
pbmc <- pbmc %>% RunTSNE(dims=pc.num) %>% RunUMAP(dims=pc.num) %>%
  FindNeighbors(dims = pc.num) %>% FindClusters()

這實際上是沒有必要的必須保持一致的。下游的都是用pca之后的，pca是為了壓縮數(shù)據(jù)。
umap和tsne是為了可視化(僅僅是可視化)，但是FindNeighbor是計算細(xì)胞間距離矩陣。找類群數(shù)目和可視化可以說沒有關(guān)系。

36. UMAP圖的分群可視化

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork) 
library(tidyverse)
library(cowplot)
library(clustree)

# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
pbmc <- NormalizeData(pbmc)
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc,dims=1:20,resolution = seq(from=0,by=.2,length=10))
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)
clustree(pbmc)

Idents(pbmc) <- "RNA_snn_res.1"
p<- map(c(levels(Idents(pbmc))),function(x){DimPlot(pbmc, cells.highlight = CellsByIdentities(object = pbmc, idents = x))})
wrap_plots(plots = p, nrow=3) 
## 對比27，不必先設(shè)置p=list()就可以直接使用wrap_plots是因為map生成的對象就是個list
# 或 plot_grid(plotlist = p)

map函數(shù)：
R語言循環(huán)第三境界：purrr包map函數(shù)！
淺析R語言中map(映射)與reduce(規(guī)約)

37. RunUMAP()不同參數(shù)對分群的影響

38. 批量讀入矩陣并創(chuàng)建seurat對象
    ??assign()的用法

# Data loading and QC

### 讀入sample消息
samples <- read_excel("../data/metadata/patients_metadata.xlsx", range = cell_cols("A:A")) %>% .$sample_id
samples
#  [1] "p018t" "p018n" "p019t" "p019n" "p023t" "p024t" "p027t" "p027n" "p028n"
# [10] "p029n" "p030t" "p030n" "p031t" "p031n" "p032t" "p032n" "p033t" "p033n"
# [19] "p034t" "p034n"

### import cellranger files from different data sets
for (i in seq_along(samples)){
  assign(paste0("scs_data", i), Read10X(data.dir = paste0("../data/cellranger/", samples[i], "/filtered_feature_bc_matrix")))
}
# 讀入的每一個文件都是一個對象，命名為scs_data1-20

### create seurat objects from cellranger files
for (i in seq_along(samples)){
  assign(paste0("seu_obj", i), CreateSeuratObject(counts = eval(parse(text = paste0("scs_data", i))), project = samples[i], min.cells = 3))
}
# 對每一個scs_data創(chuàng)建一個Seurat對象，命名為seu_obj1-20

### merge data sets
seu_obj <- merge(seu_obj1, y = c(seu_obj2, seu_obj3, seu_obj4, seu_obj5, seu_obj6, seu_obj7, seu_obj8, seu_obj9, seu_obj10, seu_obj11, seu_obj12, seu_obj13, seu_obj14, seu_obj15, seu_obj16, seu_obj17, seu_obj18, seu_obj19, seu_obj20), add.cell.ids = samples, project = "lung")

### calculate mitochondrial, hemoglobin and ribosomal gene counts
seu_obj <- PercentageFeatureSet(seu_obj, pattern = "^MT-", col.name = "pMT")
seu_obj <- PercentageFeatureSet(seu_obj, pattern = "^HBA|^HBB", col.name = "pHB")
seu_obj <- PercentageFeatureSet(seu_obj, pattern = "^RPS|^RPL", col.name = "pRP")

qcparams <- c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "pMT", "pHB", "pRP")
for (i in seq_along(qcparams)){
  print(VlnPlot(object = seu_obj, features = qcparams[i], group.by = "orig.ident", pt.size = 0))
}
for (i in seq_along(qcparams)){
  print(RidgePlot(object = seu_obj, features = qcparams[i], group.by = "orig.ident"))
}

VlnPlot(seu_obj, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "pMT"), pt.size = 0, group.by = "orig.ident", ncol = 1, log = T)
ggsave2("SuppFig1B.pdf", path = "../results", width = 30, height = 20, units = "cm")

39. 繪圖時顏色的傳參

ClusterName_color_panel <- c(
  "Naive CD4 T" = "#DC143C", "Memory CD4 T" = "#0000FF", "CD14+ Mono" = "#20B2AA",
  "B" = "#FFA500", "CD8 T" = "#9370DB", "FCGR3A+ Mono" = "#98FB98",
  "NK" = "#F08080", "DC" = "#0000FF", "Platelet" = "#20B2AA"
)
ggplot(df, aes(Pseudotime, colour = cell_type, fill=cell_type)) +
  geom_density(bw=0.5,size=1,alpha = 0.5)+theme_classic2()+ scale_fill_manual(name = "", values = ClusterName_color_panel)+scale_color_manual(name = "", values = ClusterName_color_panel)

參考：monocle2

40. 繪圖氣泡圖/小提琴圖的時候翻轉(zhuǎn)縱坐標(biāo)
    使用scale_y_discrete+rev

p1=DotPlot(pbmc,features = c('CCR2','CD3D'),group.by = 'cell_type')+theme_bw()
p2=DotPlot(pbmc,features = c('CCR2','CD3D'),group.by = 'cell_type')+theme_bw()+scale_y_discrete(limits = rev(levels(pbmc$cell_type)))
p1|p2

41. 添加matadata
    custom是n行1列的矩陣，行名是細(xì)胞名，一列是想要添加的信息，比如手動注釋結(jié)果等。

scRNA <- AddMetaData(scRNA, metadata=custom)

42. 批量繪制細(xì)胞群marker基因
    空轉(zhuǎn)也是一樣，把FeaturePlot()換成SpatialFeaturePlot()即可

markerlist <- list(
  Tcell = c("CD3D","CD3E"),
  CD4T = c("CD4","CD40LG"),
  CD8T = c("CD8A","CD8B"),
  Treg = c("FOXP3", "IL2RA"),
  Bcell = c("CD79B","MS4A1"),
  Plasma = c("MZB1", "XBP1"),
  Myeloid = c("LYZ","CST3"),
  Monocyte = c("FCN1","S100A9"),
  Macrophage = c("CD163","CD68"),
  DC_CD1 = c("CLEC9A", "BATF3"),
  DC_CD2 = c("CD1C", "FCER1A"),
  DC_LAMP3 = c("LAMP3", "FSCN1"),
  pDC = c("LILRA4", "IL3RA"),
  Neutrophil = c("FCGR3B", "CSF3R"),
  Epithelial = c("EPCAM", "KRT5"),
  Endothelial = c("PECAM1", "VWF"),
  Fibroblasts = c("ACTA2", "COL1A1")
)
for(i in names(markerlist)){
  markers <- markerlist[[i]]
    p <- FeaturePlot(pbmc, features = markers) + plot_layout()&theme(legend.position = "right")
  ggsave(paste0(i, ".pdf"), p, width = 10, height = 8)
}
markers <- do.call("c",markerlist)
p <- FeaturePlot(pbmc, features = markers,ncol = 4) + plot_layout()&theme(legend.position = "right")
ggsave("Markers_PBMC_all.pdf", p, width = 18, height = 30)

43. 查看不同cluster的中位基因

a<-pbmc@meta.data%>%group_by(seurat_clusters)%>%
  summarise(count=n(),nCount_RNA_M =median(nCount_RNA,na.rm = TRUE),nFeature_RNA_M=median(nFeature_RNA,rm=TRUE))
a

查看不同細(xì)胞群的中位基因也是一樣

a=pbmc@meta.data%>%group_by(cell_type)%>%
  summarise(count=n(),nCount_RNA_M =median(nCount_RNA,na.rm = TRUE),nFeature_RNA_M=median(nFeature_RNA,rm=TRUE))
a

查看不同樣品的中位基因也是一樣

pbmc@meta.data%>%group_by(sample)%>%
summarise(count=n(),nCount_RNA_M =median(nCount_RNA,na.rm = TRUE),nFeature_RNA_M=median(nFeature_RNA,rm=TRUE))%>%head()

或者也可以

dim(pbmc)
df<-data.frame(pbmc$nFeature_RNA,pbmc$nCount_RNA)
apply(df,2,median)
# pbmc.nFeature_RNA   pbmc.nCount_RNA 
#               819              2213 

44. 計算線粒體基因
    直接使用^(MT|mt|Mt)-，人和小鼠的數(shù)據(jù)都適用

pbmc[['percent.mito']] <- PercentageFeatureSet(object = pbmc, pattern = '^(MT|mt|Mt)-')

45. 使用ggplot2優(yōu)化Seurat繪圖
    需要注意的點：
    1、坐標(biāo)提取
    2、顏色對接，尤其是colorRampPalette的使用
    3、viridis的使用
    4、ggplot2的aes和aes_string

46. 使用subset去了單細(xì)胞子集之后，想要在原seurat對象上查看哪些細(xì)胞被濾掉了的方法

pbmc_new <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 500 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
cellp <-rownames(pbmc_new@meta.data)
pbmc$filter <-ifelse(rownames(pbmc@meta.data) %in% cellp,"Cell","filtered")
p1 <-DimPlot(pbmc,label = T,repel = T,reduction = "umap",group.by="filter")
p1

47.提取seurat自帶顏色

library(scales)
p1 <- DimPlot(scRNA)
x<-ggplot_build(p1)
info = data.frame(colour = x$data[[1]]$colour, group = x$data[[1]]$group)
info <- unique((arrange(info, group)))
cols <- as.character(info$colour)