Prognosis-Related Molecular Subtypes and Immune Features Associated with Hepatocellular Carcinoma

與預后相關的分子亞型和與肝細胞癌相關的免疫特征

發(fā)表期刊：Cancers (Basel)

發(fā)表日期：2022 Nov 21

影響因子：6.575

DOI:? 10.3390/cancers14225721

一、研究背景

????????原發(fā)性肝癌是全球癌癥相關死亡的第四大原因，它表現(xiàn)出顯著的組織學和生物學異質性。肝細胞癌（HCC）是最常見的類型，占原發(fā)性肝癌的90%以上。HCC的主要風險因素包括感染丙型肝炎或乙型肝炎病毒、過度飲酒、吸煙和飲食。遺傳風險因素可能與這些環(huán)境風險因素相互作用，如CTNNB1（編碼β-catenin）、TP53和AXINI基因的突變。

????????由于HCC的異質性很強，身體不同區(qū)域的腫瘤可能代表不同的亞型。這些亞型在代謝和信號通路上可能有所不同，導致患者生存期的差異。

二、材料與方法

1、數(shù)據(jù)來源

1）從廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收集了六對HCC和配對的癌旁正常組織樣本，這些樣本是在不同的臨床階段被病理診斷為HCC的患者

2）從TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌（LIHC）數(shù)據(jù)集中下載了371個原發(fā)腫瘤樣本、3個復發(fā)腫瘤樣本和50個正常組織樣本的基因表達譜

3）在GEO數(shù)據(jù)庫，獲得了GSE14520（225個HCC組織和220個非腫瘤組織）、GSE76427（52個相鄰的非腫瘤組織和115個HCC組織）、GSE25097（268個HCC組織和243個鄰近的非腫瘤組織）、GSE138178（49個HCC組織和配對的鄰近非腫瘤組織）、GSE84006（38個原發(fā)性HCC組織和配對的鄰近非腫瘤肝組織）、GSE136319數(shù)據(jù)集（秘魯患者的47個腫瘤和47個非腫瘤肝臟組織的DNA甲基化數(shù)據(jù)）

2、分析流程

流程圖

三、實驗結果

01 - HCC中的DEGs及其功能富集度

????????為了確定與HCC預后相關的基因，作者首先利用TCGA、GSE76427、GSE25097和GSE14520數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進行了差異分析（圖2A,B）。在四個數(shù)據(jù)集重疊的4036個交叉的DEGs中，有2058個上調，1272個下調，706個DEGs表達方向不同（圖2C）。功能富集分析表明，激活了各種與HCC相關的途徑，如P53信號通路、色氨酸代謝以及初級膽汁酸生物合成（圖2D）。重疊的DEGs可能參與了細胞的氨基酸分解過程、羧酸分解過程和其他代謝過程（圖2E）。

圖2 HCC的DEGs及其在生物過程和KEGG途徑中的富集程度

????????GSEA顯示，DEGs與細胞周期、錯配修復和DNA復制正相關，但與礦物質吸收、PPAR信號傳導以及補體和凝血級聯(lián)負相關。在GSE14520中，預測HCC患者5年OS的AUC是58%。Cox回歸和KM分析也顯示，3330個重疊的DEG中，有217個與HCC預后密切相關，而使用Metascape的進一步富集分析顯示，這些預后基因在小分子分解代謝、小分子生物合成和有絲分裂細胞周期中明顯富集。

????????為了評估TCGA和GSE14520中預后相關基因的診斷價值，作者計算了它們的AUC值，并從217個AUC>0.80的預后基因中選出138個（圖3A）。然后對這138個基因進行單變量Cox分析，得到10個相對重要性大于0.2的生存相關基因（圖3B）。隨后的LASSO回歸確定了七個特征基因：SORBS2, DHRS1, SLC16A2, RCL1, IGFALS, GNA14和FANCI，預測5年OS的AUC為0.744（圖3C-E）。然后用GMM模型將7個特征基因的表達數(shù)據(jù)整合成3個群組127個組合，并選擇AUC最高的群組來識別預測HCC復發(fā)的強勢特征基因。經GMM分類器測定，127個組合中的1個特征基因的平均準確率為0.9901（圖3F）。通過單變量Cox回歸分析進一步調查特征基因的獨立預后價值，表明FANCI在兩個數(shù)據(jù)集中都與不良的OS顯著相關（圖3G，H），表明它可能作為HCC復發(fā)的一個新的預測生物標志物。

圖3 單變量Cox和LASSO回歸

02 - 基于特征基因的預后風險評分作為HCC的預后工具

????????根據(jù)風險評分的中位數(shù)將HCC患者分為高風險組和低風險組（圖4A,B），在GSE14520和TCGA數(shù)據(jù)中，其預測1、3、5年OS的AUC值均大于0.65（圖4C,D）。使用整合了特征基因和臨床病理風險因素的nomogram對OS預測進行了量化（圖4E）。校準圖也顯示，nomogram與理想模型相比表現(xiàn)良好（圖4F）。

圖4 基于特征基因的風險評分可作為HCC的預后工具

????????為了確定HCC的分子亞型，根據(jù)217個預后相關基因對GSE14520和TCGA數(shù)據(jù)庫的HCC樣本進行了NMF聚類（圖5A-C）。能夠將HCC患者分為兩個分子亞型（圖5C）：預后差的HCC的C1亞型，和OS良好的C2亞型（圖5E）。還發(fā)現(xiàn)GSE14520的剪影寬度值為0.85（圖5D），TCGA的剪影寬度值為0.88，這表明HCC樣本與兩個不同亞型之間有很好的相關性。

圖5 基于GSE14520數(shù)據(jù)集的HCC亞型確定

03 - HCC亞型對免疫療法和化療藥物的敏感性

????????GSE14520和TCGA中兩種HCC亞型的臨床數(shù)據(jù)分布比較表明，兩種亞型的年齡沒有明顯差異，但男性比女性更容易患兩種亞型的疾病。此外，根據(jù)GSE14520（圖6B）和TCGA（圖6C）的數(shù)據(jù)，C1亞型顯示出比C2亞型更短的生存期（圖6A），以及對CTLA4-R治療更大的反應性。相反，TCGA中的C2亞型對抗癌藥物ZM.447439和AG.14699的反應性明顯大于C1亞型（圖6D）。

圖6 肝細胞癌C1和C2亞型的藥物敏感性和免疫治療反應

04 - 干性指數(shù)和FANCI的表達

????????根據(jù)干性指數(shù)值對HCC樣本進行排名，顯示其臨床人口學特征與mRNAi明顯相關（圖S4A）。FANCI與干性指數(shù)正相關（圖S4B），它在GSE138178和GSE84006數(shù)據(jù)集中都是上調的（圖S4C，D）。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進一步分析FANCI在各種癌癥類型中的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)FANCI在肝癌中與正常組織相比明顯上調（圖S4E）。這些結果被TCGA RNA測序數(shù)據(jù)在TIMER中證實，表明FANCI在腫瘤中的水平明顯高于鄰近的正常組織（圖S4F）。

圖S4 臨床人口學特征與基于mRNAsi和FANCI在HCC的表達有關

????????為了探索FANCI在HCC預后中的作用，作者進行了時間-ROC分析，結果顯示，在GSE14520數(shù)據(jù)集中預測5年OS的AUC最高（圖7A），而在TCGA中預測1、3、5年OS的AUC都大于0.60（圖7B）。FANCI的AUC在所有四個數(shù)據(jù)集中都高于0.90（圖7C）。富集分析顯示，F(xiàn)ANCI與纖維蛋白溶解的調節(jié)、環(huán)氧酶P450途徑和蛋白激活級聯(lián)呈正相關，而與錯配修復、中心體分離和轉體合成呈負相關（圖7D）。此外，F(xiàn)ANCI與細胞周期、DNA復制和蛋白酶體正相關，而與FOXO、IL-17和p53信號通路負相關（圖7E）。

圖7 FANCI與生物和KEGG途徑的時間-ROC分析和關聯(lián)性

????????還發(fā)現(xiàn)在人類蛋白質圖譜數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)ANCI在HCC組織中的表達高于對照組（圖8A）。同樣，6名HCC患者的轉錄組測序結果顯示，與鄰近患者相比，F(xiàn)ANCI在HCC中高表達，特別是在腫瘤進展的患者2（RFS 66天）和5（RFS 248天）（圖8B-D）。同時，F(xiàn)ANCI在以前的研究中被確定為Wnt信號的下流基因，調節(jié)HCC的早期復發(fā)。這些結果提示，它可能正向調節(jié)范可尼貧血癥的途徑（圖8E）。

圖8 FANCI在HCC中的潛在調節(jié)機制

05 - 免疫細胞浸潤、體細胞突變和DNA甲基化

????????為了探索免疫細胞浸潤在HCC中的潛在臨床意義，作者確定了所有四個數(shù)據(jù)集的浸潤水平（圖9A）。與對照組相比，HCC樣本中T輔助2型（Th2）、T輔助和前樹突狀細胞明顯上調，而T細胞和細胞毒性細胞與C1亞型明顯相關（圖9B）。還分析了HCC組織中24種免疫細胞類型之間的相關性（圖9C），并構建了四個集群，顯示了彼此之間的正負相關（圖9D）。此外，樹突狀細胞和Th12細胞與七個特征基因相關，而Th2細胞和FANCI之間有明顯的相關性（圖9E）。CIBERSORT算法還顯示，大多數(shù)浸潤的免疫細胞是T細胞（圖9E）。

圖9 免疫細胞之間的浸潤和關聯(lián)性

????????根據(jù)顯示至少20倍覆蓋率的測序數(shù)據(jù)，在364名HCC患者中鑒定了體細胞單核苷酸變異。發(fā)現(xiàn)突變使腫瘤抑制基因TP53（占所有患者的31%）、AXINI（8%）和RB1（5%）失活（圖S5A）。此外，發(fā)現(xiàn)FANCI在HCC患者中有兩個位點發(fā)生突變，這些突變可能會影響蛋白功能（圖S5B）。進一步發(fā)現(xiàn)FANCI的mRNA水平與蛋白水平呈負相關，這意味著該基因會受到甲基化的影響（圖S5D）。對GSE136319中秘魯肝癌患者HCC和非腫瘤組織之間差異甲基化的基因分析表明，甲基化修飾被調查（圖S5C）。此外，MEXPRESS工具顯示，TCGA中FANCI啟動子區(qū)域的甲基化水平在HCC樣本中明顯高于正常組織。

圖S5 肝細胞癌的基因組圖譜和DNA甲基化變化

四、結論

????????作者利用生物信息學比較了腫瘤和非腫瘤組織之間的基因表達，以確定HCC分子亞型和生物標志物來幫助預測預后。此外，使用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）來確定免疫浸潤的水平并描述腫瘤免疫微環(huán)境的特征。本研究確定了HCC患者的兩種分子亞型，并檢測了可能作為HCC潛在生物標志物和治療目標的關鍵基因。