主要內容：
一、SDS-PAGE的工作原理
SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是實驗室常用的基于蛋白質分子量對蛋白質進行分離的方法。
SDS-PAGE根據(jù)蛋白質的分子量來分離蛋白質，基于施加電場的作用下通過篩分基質（凝膠）產生的遷移率。
1.? 使蛋白質的遷移率與分子量成正比
任何帶電物種在電場中的運動都是由其凈電荷、分子半徑和外加電場的大小決定的。但自體折疊的蛋白質所帶來的問題是，它們的凈電荷和分子半徑都不依賴于分子量。相反，它們的凈電荷由氨基酸組成決定，即蛋白質中的氨基酸正、負電荷之和以及蛋白質三級結構的分子半徑?jīng)Q定。??
因此，在它們的原生狀態(tài)下，具有相同分子量的不同蛋白質在電場中以不同的速度遷移，這取決于它們的電荷和三維形狀。??
為了根據(jù)分子量在電場中分離蛋白質，我們需要將蛋白質還原為線性分子，破壞三級結構，并以某種方式掩蓋蛋白質的固有凈電荷。這就是SDS的應用來源。
2.? SDS的作用
SDS是一種存在于SDS-PAGE緩沖液中的洗滌劑，在這種緩沖液中，伴隨著一點煮沸和還原劑（通常是DTT或β-ME來分解蛋白質-蛋白質二硫鍵），它會破壞蛋白質的三級結構。這將折疊的蛋白質轉變?yōu)榫€性分子。
SDS利用均勻的負電荷覆蓋蛋白質，從而掩蓋R-基團的固有電荷。SDS與線性蛋白（約1.4g SDS/1g蛋白）的結合相當均勻，這意味著蛋白質的電荷現(xiàn)在與它的分子量近似成正比。??
SDS也存在于凝膠中，以確保一旦蛋白質被線性化，電荷被掩蓋，但蛋白質在整個電泳分離過程中仍保持這種方式（與分子量成正比的遷移）。??
SDS包被的蛋白在凝膠中的遷移率的主要決定性因素是它的分子半徑。??
SDS包被的蛋白已被證明是線性分子，18?寬，長度與分子量成正比，因此分子半徑（它們在凝膠中的遷移率）由蛋白質的分子量決定。由于SDS包被的蛋白質具有相同的電荷質量比，因此不存在基于電荷的差異遷移。
3. 凝膠基質
在外加電場中，SDS處理后的蛋白質現(xiàn)在將以不同分子量產生的不同速率向陰極移動。這些不同的遷移率將被凝膠基質的高摩擦環(huán)境擴大。
SDS-PAGE的凝膠基質是聚丙烯酰胺，它具有化學惰性，并且至關重要的是可以很容易地在各種濃度下制備不同的孔徑，可以產生不同的分離特性。
4. 不連續(xù)緩沖體系與濃縮凝膠
為了通過凝膠將電流從陽極傳遞到陰極，需要緩沖液。我們通常使用不連續(xù)Laemmli緩沖系統(tǒng)。 “不連續(xù)”僅僅意味著凝膠和電泳槽的緩沖液是不同的。??
通常，該系統(tǒng)采用pH6.8的Tris-HCl緩沖液配置的濃縮膠，pH8.8的Tris-HCl緩沖液配置的分離膠以及pH8.3的電極緩沖液，濃縮膠具有低濃度的丙烯酰胺，分離膠具有更高的濃度，能夠延緩蛋白質的運動。
那些不同的pH是怎么回事兒？甘氨酸可以以三種不同的電荷狀態(tài)存在，正電荷、中性電荷或負電荷，這取決于pH值。用不同的緩沖液控制甘氨酸的電荷狀態(tài)是整個濃縮膠的關鍵。
同時，這也是濃縮膠的工作原理，當電源接通時，在pH 8.3電極緩沖液中帶負電荷的甘氨酸離子被迫進入濃縮膠（pH為6.8），在這種環(huán)境中，甘氨酸主要轉變?yōu)閮尚噪x子（中性電荷）狀態(tài)。電荷的這種損失使它們在電場中移動得非常緩慢。??
另一方面，氯離子（來源于Tris-HCl）在電場中移動得很快，它們形成一個離子鋒，在甘氨酸之前遷移。從Tris平衡離子（正朝陰極移動）中分離出的Cl-形成一個具有陡峭電壓梯度的狹窄區(qū)，該電壓梯度將甘氨酸往后拉，導致遷移離子產生兩個狹長遷移前沿，高流動性的Cl-前沿，然后是較慢的中性甘氨酸前沿。??
所有凝膠中的蛋白質樣本的電泳遷移率處在甘氨酸和Cl-遷移率的極值之間。因此當兩個前沿進入樣品孔時，蛋白質濃縮到Cl-和甘氨酸之間的狹窄區(qū)。
5. 當?shù)鞍踪|離開濃縮膠
濃縮膠遷移過程結束后，進入分離膠，pH轉變?yōu)?.8，在該pH下，甘氨酸分子大多帶負電，遷移速度比蛋白質快得多。因此，甘氨酸加速通過蛋白質，而蛋白質留在分離膠中。??
結果是，蛋白質在濃縮和分離膠的界面處被濃縮到非常窄的帶中，并且由于分離膠中丙烯酰胺濃度的增加，這減緩了蛋白質根據(jù)其分子量大小的運動，分離開始。
6. 濃縮膠起到了什么作用
濃縮膠膠孔約1cm深，通常需要填充足夠的蛋白在凝膠上。因此，缺少濃縮膠的情況下，樣本則置于分離膠上，而樣本條帶將達到1cm深。??
與濃縮成一條帶同時進入分離膠相比，沒有濃縮膠意味著蛋白質在不同時間分別進入濃縮膠而形成彌散條帶。
因此，濃縮膠確保蛋白質同時達到分離膠，分子量相同的蛋白質則形成緊密條帶進行遷移。
7. 蛋白質分離
一旦蛋白質進入分離膠，則因高分子量蛋白質通過多孔丙烯酰胺凝膠的速度比低分子量蛋白慢而被分離。凝膠孔的大小可以根據(jù)丙烯酰胺濃度和蛋白質分子量大小而改變。??
對于更寬的分離范圍，或對于難以分離的蛋白質，可以使用具有丙烯酰胺濃度增加的梯度凝膠。
二、蛋白酶和蛋白酶抑制劑工作原理
1. 蛋白酶：好的，壞的，水解的
所有生物體都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉鈴蟲。雖然蛋白酶涉及到從宿主防御到傷口愈合乃至病毒復制的各個方面，但根據(jù)蛋白酶活性位點的構成和與目標肽鍵的相互作用，可以大致分為兩大類。
1）通過絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸在其活性部位的親核活化水解鍵；
2）天冬氨酸、谷氨酸和金屬蛋白酶，利用水本身進行水解。
2. 抑制劑：你不能只靠一種
化學分解、碰撞摩擦、超聲波和凍融，把整個系統(tǒng)都弄得亂七八糟。沒有肽鍵是安全的！??
外肽酶攻擊氨基酸鏈的末端，而內肽酶水解它們的內部連接。激酶磷酸化和去磷酸化隨意。??
沒有一種抑制劑能清除所有蛋白酶，阻止每一個磷酸化事件。它需要一種“雞尾酒”的方法來阻止蛋白質分解。蛋白酶抑制劑在脅迫下可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化鈉，也可以是進化過程中自身微生物抑制劑多肽類似物。它們可以與底物競爭活性位點，有時會破壞或者囤積蛋白酶功能所需的珍貴陽離子。??
競爭性抑制劑的作用是以類似底物的方式與活性位點結合通過修飾阻止蛋白酶，例如，酯化反應。許多大的競爭抑制劑通過增強親和性和特異性結合。??
競爭性的阻礙因素。因素種類繁多，從抑肽酶，一種6kDa的多肽絲氨酸蛋白酶（在極端的pH值是可逆的），到正釩酸鈉，一種抑制易受騙蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。
螯合劑利用它們對金屬離子的增強親和力與金屬離子螯合，而不能與其他成員發(fā)生反應。金屬蛋白酶的活性部位需要鋅、鎂、錳、鈣，甚至鈷來活化水，水解肽鍵，以達到水解目的。把鋅和乙二胺四乙酸（EDTA）結合起來，把鈣和乙二胺四乙酸（EGTA）結合起來，金屬蛋白酶就不再有活性了。
三、瓊脂糖凝膠不是通過聚合形成的
1.瓊脂糖凝膠不是通過聚合形成的
聚丙烯酰胺主要用于SDS-PAGE，是由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺單體組成的基質。它的優(yōu)點是化學惰性，因此在蛋白質通過時不會與蛋白質發(fā)生相互作用，而且它可以用不同的孔徑輕松地、重復地制造出具有不同分離特性的凝膠。
聚合反應，是自由基催化的乙烯基加成反應。該反應由TEMED引發(fā)，引發(fā)過硫酸銨（APS）自由基的生成。自由基將電子轉移到丙烯酰胺/雙丙烯酰胺單體上，使它們呈放射狀并相互作用形成聚丙烯酰胺鏈。
在缺失雙丙烯酰胺的情況下，丙烯酰胺會聚合成長鏈，而不是多孔凝膠。雙丙烯酰胺交聯(lián)丙烯酰胺鏈，是形成多孔凝膠基質的原因。通過改變丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的比例，可以控制交聯(lián)的量，決定凝膠的孔徑和分離特性。
2. 瓊脂糖凝膠形成
瓊脂糖—凝膠瓊脂的主要成分，可以從某些海藻中分離出來—本身就是一種聚合物。但是，聚合不是瓊脂糖凝膠形成的機制。??
在化學上，瓊脂糖是一種多糖，其單體單元是D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳吡喃糖的二糖。
在低于35℃的水溶液中，這些聚合物鏈通過非共價鍵相互作用（像氫鍵）和靜電相互作用被保持在多孔凝膠結構中。?
加熱溶液會破壞這些非共價相互作用，并使鏈脫離。??
當溶液冷卻時，這些非共價相互作用被重新建立并且形成凝膠。?
所以，瓊脂糖（和瓊脂）凝膠是通過氫鍵和靜電相互作用而不是通過聚合形成的。
四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的
乙醇沉淀法是一種在水溶液中濃縮和脫鹽核酸（DNA或RNA）的常用方法。最基本的步驟是在水溶液中加入鹽和乙醇，迫使核酸從溶液中沉淀出來。
通過離心分離沉淀的核酸。核酸顆粒在70%的冷乙醇中洗滌，進一步離心后，干燥去除乙醇，核酸顆粒被重新懸浮在干凈的緩沖液中。
1. 關于溶解度
首先我們需要知道為什么核酸能溶于水。水是一個極性分子，由于非共享的電子對，它在氧原子附近有部分負電荷，在氫原子附近有部分正電荷。??
由于這些電荷，極性分子，如DNA或RNA，可以與水分子靜電作用，使它們很容易溶于水。??
因此，極性分子可以被描述為親水性分子，而非極性分子是疏水性的，它們不易與水分子相互作用。?
核酸是親水性的，這是由于糖磷酸主鏈上帶負電荷的磷酸（PO3-）基團。
2.? 鹽的作用
鹽在實驗中的作用是中和糖磷酸骨架上的電荷。一種常用的鹽是醋酸鈉（乙酸鈉），在溶液中，乙酸鈉分解成NA+和[CH3COO]-。??
帶正電的鈉離子中和了核酸上PO3-基團的負電荷，使分子的親水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。
3. 乙醇的作用
溶液中Na+離子與PO3-離子之間的靜電吸引受庫侖定律的支配，受溶液介電常數(shù)的影響。??
水具有很高的介電常數(shù)，這使得Na+和PO3-很難結合在一起。??
另一方面，乙醇具有較低的介電常數(shù)，使得Na+更容易與PO3-相互作用，屏蔽其電荷，使核酸不太親水，導致其從溶液中脫落。
4. 溫度的作用
低溫（如-20或-80℃）下保存核酸/鹽/乙醇混合物用于沉淀核酸通常在實驗中認為是必要的。??
然而，這不是必需的，因為濃度低至20ng/mL的核酸在0-4℃時會沉淀，因此在冰上孵育15-30分鐘就足夠了。
5. 70%無水乙醇洗滌步驟
把沉淀的DNA顆粒中的殘留鹽洗掉。
6. 關于核酸沉淀的一些建議：
a. 鹽的選擇
使用醋酸鈉（0.3M終濃度，pH值5.2）進行常規(guī)DNA沉淀；??
對于含有SDS的DNA樣品，使用氯化鈉（終濃度為0.2M），因為NaCl使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不會與DNA一起沉淀；??
對于RNA，使用氯化鋰（0.8M終濃度）。這是因為2.5-3體積的乙醇應用于RNA沉淀，而LiCl比NaAC更易溶于乙醇，因此不會沉淀，但要注意氯離子會抑制蛋白質合成和DNA聚合酶，因此LiCl不適合用于體外翻譯或反轉錄RNA的制備。在這種情況下，使用NaAC。
使用乙酸銨（2M終濃度）去除dNTPs，但不用于制備應用于T4多核苷酸激酶反應的DNA，因為銨離子抑制酶活性。
提高低濃度或小核酸片段沉淀的產率（<100個核苷酸）
a. 將MgCl2添加至最終濃度0.01M ；
b. 將離心前在冰上孵育的時間增加到1小時。
