第二代DNA測(cè)序技術(shù)
大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)（massively parallel DNA sequencing platform）的出現(xiàn)不僅令DNA測(cè)序費(fèi)用降到了以前的百分之一，還讓基因組測(cè)序這項(xiàng)以前專屬于大型測(cè)序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測(cè)序技術(shù)有助于人們以更低廉的價(jià)格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測(cè)序儀產(chǎn)品，例如美國Roche Applied Science公司的454基因組測(cè)序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測(cè)序儀、美國Applied Biosystems公司的SOLiD測(cè)序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。
以Illumina測(cè)序儀說明二代測(cè)序的一般流程:
- 文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸黏性末端。然后將Illumina測(cè)序接頭與片段連接。
- 簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測(cè)序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。
- 測(cè)序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一個(gè)循環(huán)開始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解。
- 數(shù)據(jù)分析。
RNA-Seq
RNA-Seq，即RNA測(cè)序又稱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,是基于第二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法：首先提取生物樣品的全部轉(zhuǎn)錄的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為c-DNA后進(jìn)行的二代高通量測(cè)序，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行片段的重疊組裝，從而可得到一個(gè)個(gè)的轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)而可以形成對(duì)該生物樣品當(dāng)前發(fā)育狀態(tài)的基因表達(dá)狀況的全局了解（globle）。進(jìn)一步說，若和下一階段的生物樣品的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，則可以得到全部的（在轉(zhuǎn)錄層面）基因表達(dá)的上調(diào)及下調(diào)--這就形成了表達(dá)譜，針對(duì)關(guān)鍵基因則可以形成你要想要的pathway的構(gòu)建。
RNA-seq能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè), 在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時(shí), 還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本, 精確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性), 提供更為全面的轉(zhuǎn)錄組信息。該技術(shù)首先將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 文庫(利用最新的SMS技術(shù)可略去這一步, 直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序), 然后將cDNA 文庫中的 DNA 隨機(jī)剪切為小片段(或先將RNA片段化后再反轉(zhuǎn)錄), 在cDNA兩端加上接頭利用新一代高通量測(cè)序儀測(cè)序, 直到獲得足夠的序列, 所得序列通過比對(duì)(有參考基因組)或從頭組裝(de novo assem- bling)(無參考基因組)形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。
RNA-Seq技術(shù)具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì):
- 數(shù)字化信號(hào)
- 高靈敏度
- 任意物種的全基因組分析
- 更廣的檢測(cè)范圍
具體請(qǐng)查找相關(guān)文獻(xiàn)
參考資料：
- 一代、二代、三代測(cè)序技術(shù)
- 維基百科
- 祁云霞, 劉永斌, 榮威恒. 轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù) ：RNA-Seq 及其應(yīng)用[J]. 遺傳, 2011(11)
