???本文記錄我使用PsRobot的psRobot_tar模塊識(shí)別靶基因的過程。踩了不少坑，供實(shí)驗(yàn)室?guī)煹軒熋脗兘梃b學(xué)習(xí)。本文參考：

• PsRobot: a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox
• miRNA靶基因預(yù)測(cè)：psRoBot

1. psRobot_tar模塊 is designed to find potential small RNA targets;
   psRobot_tar 識(shí)別潛在的小RNA 的靶基因。

2. psRobot_map模塊 is designed to find all perfect matching locations of short sequences (less than 40bp) in longer reference sequences;
   psRobot_map 在更長(zhǎng)的參考序列上找出所有完美匹配的短序列(小于40bp)。

3. psRobot_mir模塊 is designed to find small RNAs with stem-loop precursors (e.g. miRNAs or shRNAs) for a batch of input sequences from high throughput sequencing data;
   psRobot_mir 可為一批來自高通量的輸入序列尋找具有莖環(huán)前體的小RNA(如miRNA或shRNA)。

4. psRobot_deg模塊 is designed to identify which small RNA targets are supported by user specified degradome data.
   psRobot_deg 用于識(shí)別哪些小RNA靶標(biāo)得到了用戶指定的降解組數(shù)據(jù)的支持。

下面我們借助psRobot_tar模塊識(shí)別miRNA的靶基因，let's go。

1. 下載、處理mature.fa文件

• 1. 從mirBase下載，mature.fa 文件
     ?? 注意：最好迅雷下載，不知道為何，瀏覽器直接下載，下載不了。
• 2. 使用Notepad++ 軟件處理，刪除其他物種的miRNA，僅保留小麥的，另存為tae_miR.fa.

2. 從Ensembl plants 下載cDNA文件。

Triticum_aestivum.IWGSC.cdna.all.fa

3. 使用xftp 上傳至服務(wù)器

• Triticum_aestivum.IWGSC.cdna.all.fa
• tae_miR.fa

4. 簡(jiǎn)化Triticum_aestivum.IWGSC.cdna.all.fa 和tae_miR.fa文件

刪除以">"開始的行中cdna 及以后的信息

sed  -ri   '/>/s/cdna.*$/ /g'  Triticum_aestivum.IWGSC.cdna.all.fa

簡(jiǎn)化tae_miR.fa

沒處理之前的tae_miR.fa
less -SN tae_miR.fa
===================  沒處理之前  =========================
>tae-miR159a MIMAT0005343 Triticum aestivum miR159a
UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG
>tae-miR159b MIMAT0005344 Triticum aestivum miR159b
UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG
>tae-miR160 MIMAT0005345 Triticum aestivum miR160
UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA
>tae-miR164 MIMAT0005346 Triticum aestivum miR164
UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA
===================  沒處理之前  =========================

處理tae_miR.fa，變得清爽多了
sed  -ri  '/>/s/MIMAT.*$//g'  tae_miR.fa
less -SN tae_miR.fa
===================  處理之后  ===========================
>tae-miR159a 
UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG
>tae-miR159b 
UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUG
>tae-miR160 
===================  處理之后  ===========================

5. 依賴軟件mfold3.5 安裝 (有管理員權(quán)限)

wget http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/program/WebServer/mfold.tar.gz
tar xvzf mfold.tar.gz
cd  mfold-3.5/
./configure
make
sudo make install

6. PsRobot軟件 安裝 (有管理員權(quán)限)

wget http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/program/WebServer/psRobot_v1.2.tar.gz
tar xvzf psRobot_v1.2.tar.gz
cd  psRobot_v1.2
sudo ./configure
make
sudo make install
source  ~/.bashrc 

7. PsRobot運(yùn)行

PsRobot 有一些參數(shù)：

psRobot_tar  -s  tae_miR.fa  -t  Triticum_aestivum.IWGSC.cdna.all.fa  -p 8  -o  target_results.gTP

使用cDNA序列不用genomic序列的原因是，miRNA在細(xì)胞質(zhì)和靶基因結(jié)合發(fā)揮作用。此時(shí)靶基因還有UTR區(qū)域但是已經(jīng)沒有內(nèi)含子區(qū)了。(考慮到UTR區(qū)域的序列特點(diǎn)，其實(shí)用CDS序列也行)

psRobot_tar 的參數(shù):

• -s input file name: smRNA sequences (fasta format)；default = smRNA
  待預(yù)測(cè)的miRNA，fasta格式；默認(rèn)：smRNA

• -t input file name: target sequences (fasta format)，default = target
  用于搜索的cDNA序列，fasta格式；默認(rèn)： target

• -o output file name，??注意：default = smRNA-target.gTP
  輸出文件名，默認(rèn)：smRNA-target.gTP

• -ts target penalty score, lower is better (0-5)，default = 2.5
  輸出結(jié)果的閾值，默認(rèn)：2.5

• -fp 5 prime boundary of essential sequence (1-2)，default = 2
  5'后第幾位開始是必要區(qū)間(1~2)， 默認(rèn)：2

• -tp 3 prime boundary of essential sequence (7-31)， default = 17
  3'后第幾位開始是必要區(qū)間(7~31)， 默認(rèn)：17

• -gl position after which with gap/bulge permit (0-30), 0 means no gap/bulge permitted， default = 17
  從第幾個(gè)堿基后允許出現(xiàn)gap/bulge， 默認(rèn)：17

• -p number of processors use，default = 1，
  使用線程數(shù)， 默認(rèn)：1，??注意：根據(jù)實(shí)際情況可以改大些

• -gn number of gaps/bulges permitted (0-5)， default = 1
  允許存在幾個(gè)gap/bulge， 默認(rèn)：1

8. 結(jié)果查看

less  -SN target_results.gTP
======================================================
1 >tae-miR159a    Score: 2.5      TraesCS7A02G377100.1  
2 
3 Query:          1 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTG^M 22
4                   *|||||*||||||||||||::*
5 Sbjct:       1095 TAACCTTACTTCCCTCGAGGTA 1074
6 
7 
8 >tae-miR159a    Score: 2.5      TraesCS7D02G446700.1  
9 
10 Query:          1 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTG^M 22
11                   |||||*|:|||||||||||*|*
12 Sbjct:        952 AAACCAAGCTTCCCTCGAG-CG 932
13 
14 
15 >tae-miR159a    Score: 2.5      TraesCS1D02G307500.2  
16 
17 Query:          1 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTG^M 22
18                   *|||||*||||||||||||::*
19 Sbjct:       1156 TAACCTTACTTCCCTCGAGGTA 1135
======================================================

9. 將靶基因?qū)Υ嬗趍iRNA-mRNA.txt 文件

cat  target_results | grep  "^>"   | cut  -f  1,3 | sed 's/>//g' >>miRNA_mRNA.txt