Expression pattern of secretory-cell-related transcriptional signatures in colon adenocarcinomas defines tumor microenvironment characteristics and correlates with clinical outcomes

結腸腺癌中分泌細胞相關轉錄特征的表達模式定義了腫瘤微環境特征并與臨床結果相關聯

發表期刊：Mol Oncol

發表日期：2022 Nov 8

影響因子：7.449

DOI:? 10.1002/1878-0261.13338

一、研究背景

????????腸粘膜中細胞增殖、分化和凋亡之間的平衡被破壞，導致粘膜穩態環境失調是結腸癌的早期征兆之一。在結腸粘膜的各種細胞類型中，分泌細胞代表了分化細胞的主要群體之一，由于這些細胞與不同的含粘液結腸癌組織學亞型密切相關，它們在驅動一部分結腸癌中的作用受到了廣泛關注。

????????腸道內分泌細胞和腺泡細胞是兩種主要的分泌細胞類型。兩者都來自LGR5+多能干細胞，其分化途徑受Notch信號控制。在生理上，為了應對腔內刺激，腸道內分泌細胞會分泌各種肽類激素，分別以傳統的內分泌和旁分泌方式作用于遠處的器官和鄰近的細胞，而吞咽細胞會排出其粘蛋白顆粒，與水、鹽和其他蛋白質結合。

????????此外，在腸道炎癥期間，分泌細胞和免疫細胞之間的機理和生化交叉對話已被大量研究證實，這也促使分泌細胞在塑造結腸癌腫瘤微環境（TME）異質性中的潛在作用。因此，更全面地了解分泌細胞和免疫細胞之間的相互作用，將有助于加深我們對癌癥免疫的理解。

二、材料與方法

1 、數據來源

1） GEO數據集：GSE17538、GSE33113、GSE37892、GSE38832和GSE39582

2） TCGA數據集

3） 中山大學腫瘤中心組織學診斷為非轉移性結腸癌的30個新鮮樣本的RNA測序數據，作為外部驗證隊列

2、分析流程

流程圖

三、實驗結果

01 - 與分泌細胞相關轉錄特征的表達水平相關的TME、生物學和臨床特征

????????作者首先探討了分泌細胞相關轉錄特征的表達水平在結腸癌患者腫瘤中的作用。如圖1A所示，在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，腸道內分泌細胞和亞型2吞噬細胞特征的表達水平存在明顯的正相關，而亞型1吞噬細胞特征的表達水平則與上述兩種細胞類型特征無關。在分泌細胞相關特征的PCA評分與TME細胞相關特征的相關性方面（圖1A，左），發現在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，腸內分泌細胞和亞型2型吞噬細胞特征的PCA評分都與基質細胞和一些骨髓細胞類型的評分表現出明顯的正相關。相應地，腸道內分泌細胞和2型鵝口瘡細胞特征的PCA評分與基質相關途徑的激活水平之間也存在高度顯著的正相關（圖1A，右）。接下來的KEGG分析不僅證實了基質相關途徑的激活程度與腸內分泌細胞和亞型2腺細胞的PCA分數之間的正相關，而且還發現亞型1腺細胞特征的估計分數與多種細胞代謝途徑之間存在明顯的正相關。在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，比較不同共識分子亞型（CMS）中分泌細胞相關特征的富集程度，發現腸內分泌細胞和亞型2吞咽細胞特征的PCA得分在CMS4患者的組織中最高，這主要代表基質/間質表型；亞型1吞咽細胞特征的得分在CMS3患者的組織中最高，該亞型以突出代謝激活為特征（圖1B)。

????????接下來探討了結腸癌患者中分泌細胞相關特征的表達水平的臨床意義。如圖1C所示，與亞型腺泡細胞不同，其PCA評分與患者的生存率沒有明顯的相關性，而腸內分泌細胞和亞型腺泡細胞特征的水平較高，表明復發的風險明顯較高。在總生存期（OS）中，發現腸內分泌細胞和2型小腸球菌細胞特征的PCA評分與OS時間的負相關關系僅在接受輔助化療（ADJC）的患者中顯著，這表明腸內分泌細胞和2型小腸球菌細胞的存在可能與化療耐藥有關（圖1C）。為了驗證這一假設，分析了GSE39582和TCGA-COAD隊列中分泌細胞相關特征的PCA得分與化療獲益之間的關系（圖1D）。結果顯示，在具有高度富集的腸內分泌細胞和2型嗜酸細胞特征的患者中，ADJC增加了死亡率風險（圖1D）。同時，在氟尿嘧啶無反應組中，腸內分泌細胞和亞型嗜酸細胞特征的富集水平明顯高于氟尿嘧啶反應組，而亞型嗜酸細胞特征在氟尿嘧啶反應組中明顯富集（圖1E）。綜上所述，這些結果表明，分泌細胞，特別是腸道內分泌細胞和亞型2腺泡細胞的富集水平可能是結腸癌預后和化療反應的潛在預測因素。

圖1????分泌細胞PCA評分的臨床相關性、腫瘤微環境特征和生物學功能特征。

02 - 識別分泌細胞相關的標志性表達模式

????????為了識別結腸癌中分泌細胞相關的特征表達模式，采用了無監督的K-均值聚類算法，該算法基于meta-GEO和TCGA-COAD隊列中的腸內分泌細胞、1型嗜酸細胞和2型嗜酸細胞特征的PCA得分。如圖2A,B所示，四種不同的分泌細胞相關特征的表達模式取得了最佳的聚類效果，并相應地將患者分為SCS1、SCS2、SCS3和SCS4亞型。其中，SCS1、SCS2和SCS3的樣本對腸道內分泌細胞和亞型消化道細胞特征的富集程度分別為中等、最高和最低，而SCS4則對亞型消化道細胞特征表現出密集的富集。隨后的生存分析顯示，SCS2亞型患者的無復發生存期（RFS）明顯短于其他SCS亞型的患者（圖2C）。至于OS，與腸道內分泌細胞和2號亞型腺體細胞特征的PCA評分的單變量生存分析結果類似，在GSE39582（圖2C,D）和TCGA-COAD隊列中（圖2E,F），SCS2只在接受ADJC的患者亞組中表現出明顯比其他亞型差的預后。在化療獲益方面，森林圖（圖2G）和堆積直方圖（圖2H）顯示，在GSE39582中，ADJC的表現使SCS2患者的死亡風險增加2倍以上。TCGA-COAD隊列中，氟尿嘧啶反應率也是SCS2亞型患者中最低的。相比之下，腸道內分泌細胞和2號亞型腺泡細胞特征富集水平最低的SCS3患者對氟尿嘧啶的反應率最高。綜上所述，這些數據表明，SCS2患者的臨床特征主要歸因于腫瘤組織中腸內分泌細胞和2號亞型腺泡細胞特征的高度富集。

圖2 基于PCA得分的結腸癌分泌細胞相關特征的共識聚類法

????????由于分泌細胞相關特征的PCA分數已被證明與各類TME細胞相關特征的表達水平相關，進一步比較了SCS亞型中的TME細胞相關特征。基于PCA算法，發現SCS亞型顯示出不同的TME細胞相關特征的富集（圖3A-D）。在SCS2中，多種基質細胞和具有免疫抑制特性的先天免疫細胞，如成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞的PCA得分顯示出最高水平。這表明SCS2樣本的TME可能被歸類為 "免疫排斥"表型的特征。相比之下，SCS3的TME特征與 "免疫沙漠 "表型相似，因為大多數TME細胞特征在SCS3樣本中的富集程度最低。幾乎所有TME細胞類型的PCA得分在SCS1樣本中都顯示出中等水平。此外，發現與其他亞型相比，SCS2的瘤內異質性最高（圖3E），腫瘤純度最低（圖3F）。然而，不同SCS亞型之間的腫瘤突變負擔（圖3G）和新抗原數量（圖3H）沒有明顯差異。

????????然后，通過對標志基因和KEGG基因集進行PCA算法，研究了與每個SCS亞型相關的通路激活情況。如圖3I-L所示，基質相關通路和炎癥相關通路在SCS2患者中被高度激活，但在SC3患者中被明顯抑制。此外，KRAS信號傳導在SCS2患者中被高度激活，表明KRAS信號傳導可能在SCS2腫瘤的進展中發揮重要作用。最后（圖3M,N），發現SCS2患者主要集中在顯示基質特性的多個亞型，包括HMC4、C4（CIT）、CMS4、TMEC2、Sub 3和C6（Pan-Immune，TCGA）亞型，而幾乎所有SCS4患者都富集在CMS3。然而，在GSE39582和TCGA-COAD隊列中，不同SCS亞型患者的錯配修復（MMR）或微衛星不穩定性（MSI）狀態的分布并不一致。總之，這些結果表明，SCS2患者主要表現出基質相關的TME和生物學特征，這可能是該亞型患者化療抵抗的原因之一。

圖3 不同SCS亞型的腫瘤微環境和生物學功能特征

????????為了更好地了解不同SCS亞型的生物學特征，作者在TCGA-COAD隊列中進行了多組學分析。首先，關于SMGs在不同SCS亞型中的有效突變分布，發現KRAS在整個、MSI高（MSI-H）和微衛星穩定/MSI低（MSS/MSI-L）患者隊列中SCS4亞型的突變率最高（圖4A），并且KRAS突變與1亞型腺泡細胞特征的PCA評分高度相關（圖4B）。有趣的是，在整個和MSS/MSI-L隊列中，SCS4亞型的TP53突變率明顯低于其他SCS亞型（圖4A），TP53突變與預測的氟尿嘧啶AUC值高度相關（圖4B）。值得注意的是，在MSS/MSI-L隊列中，與其他SCS亞型相比，BRAF突變在SCS2患者中明顯富集。

????????除了基因組突變外，還探討了SCS亞型之間基因啟動子甲基化水平的差異。如圖4C所示，共發現36個SVMG。在這些基因中，HYAL1、CAPN8、REG4和NAT2的甲基化程度高，轉錄表達量低，而其他基因的甲基化程度低，SCS2亞型的轉錄表達量高，這表明這些基因的甲基化可能在SCS2患者的生物學特征中起重要作用。這些SVMG的甲基化水平與分泌細胞相關特征的PCA得分和預測的氟尿嘧啶AUC值的關聯見圖4D。

????????最后，從TCGA-COAD隊列中下載了蛋白質組學數據。與轉錄組分析結果一致（圖4E,F），SCS2亞型中纖維蛋白和IV型膠原蛋白等間質標志物的蛋白表達量很高，而上皮標志物E-cadherin的蛋白表達量明顯下降，這進一步證實SCS2在蛋白水平上存在基質途徑的高度激活。

圖4 SCS亞型相關的基因組改變和甲基化特征

03 - 在meta-GEO隊列中構建SCS評分并探索其臨床相關性

????????由于SCS2亞型的患者預后較差，不能從氟尿嘧啶治療中獲益，作者認為有必要開發一個簡單的評分工具，以準確識別臨床實踐中的此類患者，并協助TNM分期，指導結腸癌的ADJC表現。在GSE39582隊列中確定了628個DEGs，并先后使用Boruta降維和LASSO-Cox回歸分析，建立了由七個基因組成的評分模型，稱為SCS評分（圖5A）。在這些基因中，ASCL2和FAM84A在SCS2亞型中下調，其表達水平與復發風險顯著負相關。其他五個基因在SCS2患者中高表達，它們的過度表達與較差的RFS明顯相關（圖5B）。小提琴圖顯示（圖5C），SCS評分的中位數在SCS2中最高，其次是SCS1亞型，而SCS3患者的評分最低。接受者操作特征（ROC）曲線分析進一步表明，SCS評分是區分SCS2亞型患者的可靠指標，診斷準確率為0.96（圖5D）。通過相關試驗（圖5E），發現SCS評分與腸道內分泌細胞和2型嗜酸細胞的PCA評分、氟尿嘧啶反應的AUC和SIIS值高度正相關，說明SCS評分是一個能反映腸道內分泌細胞和2型嗜酸細胞特征豐富程度的有效指標，與氟尿嘧啶耐藥有關。此外，SCS評分與基質途徑和基質細胞特征表達明顯正相關（圖5F），在dMMR患者中也明顯升高，這與SCS2亞型的結果一致。

????????接下來，探討了SCS評分在指示結腸癌患者的預后和化療獲益方面的作用。首先使用survminer軟件包將患者分為高和低SCS評分組，發現低SCS評分組的RFS（圖5G，左）和OS（圖5G，右）明顯較高。對SCS評分作為連續變量的進一步分析顯示，SCS評分是RFS的一個獨立預后因素。然而，在單變量（圖5H）或多變量分析中，SCS評分和OS之間的明顯相關性僅存在于接受ADJC的患者亞組。就SCS評分在預測化療獲益方面的作用而言，作者根據ROC曲線重新定義了SCS評分的臨界值，以衡量SCS評分在識別SCS2亞型方面的準確性。只有SCS評分低的患者可以從ADJC中獲益（圖5I）。總之，上述結果顯示，SCS評分是預測結腸癌患者預后和化療效果的有用生物標志物，具有良好的臨床轉化價值。

圖5 在meta-GEO隊列中構建和探索SCS得分

????????為了證實SCS評分的臨床價值和生物學意義，在TCGA-COAD和SYSUCC隊列中探討了SCS評分的作用。結果顯示，TCGA-COAD隊列中SCS評分在不同SCS亞型中的分布與meta-GEO隊列中的分布一致（圖6A），在TCGA-COAD隊列中，SCS評分在識別SCS2亞型中患者的AUC值為0.96（圖6B）。此外，與meta-GEO隊列的結果一致，在TCGA-COAD（圖6C,D）和SYSUCC（圖6E,F）隊列中都觀察到SCS評分與基質相關和炎癥相關途徑的激活水平呈正相關；腸內分泌細胞、2型吞咽細胞、基質細胞和骨髓細胞的PCA評分，以及氟尿嘧啶反應的AUC值。值得注意的是，在TCGA-COAD隊列中也觀察到MSI-H患者的SCS評分的升高。對TCGA-COAD隊列的進一步生存分析也顯示，較高的SCS評分與較高的死亡率顯著相關（圖6G）；然而，在ADJC亞組中，SCS評分在單變量（圖6H）和多變量Cox回歸中作為連續變量都與OS明顯相關。SCS高分組的患者也無法從ADJC中獲益（圖6I）。這些結果表明，SCS評分模型有很強的可重復性。

圖6 在TCGA-COAD和SYSUCC隊列中對SCS評分進行驗證

????????在此，作者使用TIDE算法來預測對免疫療法有反應的可能性。與其他SCS亞型相比，SCS2患者可能更不可能對免疫療法有反應，在GSE39582（圖7A，上）和TCGA-COAD隊列（圖7A，下）中的無反應率都是最高。一致的是，在GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中，SCS評分在預測的免疫療法無反應組中明顯上調（圖7B），并與TIDE評分明顯正相關（圖7C）。除了TIDE預測，還使用SubMap將定義的SCS亞型的表達譜與已發表的包含217名接受抗PD-L1治療的轉移性尿路上皮癌患者治療前轉錄組數據的數據集進行比較。發現SCS2亞型的樣本與抗PD-L1無反應組的樣本在標記基因表達上有明顯的相似性（圖7D），這進一步表明SCS2患者可能不是可以從ICB中獲益的候選人。

圖7 SCS評分與免疫療法益處之間的關聯

04 - SCS2亞型樣本中氟尿嘧啶抗性的候選驅動基因

????????在以前的研究中，作者通過對SW480細胞進行基于CRISPR的全基因組功能缺失篩選，確定了幾個介導結腸癌化療耐藥的驅動基因。為了探討這些驅動基因是否參與了介導由腸道內分泌細胞和2型小球細胞富集引起的氟尿嘧啶抗性，首先分析了GSE39582和TCGA-COAD隊列中SCS2（腸內分泌細胞和2型小球細胞豐度最高，氟尿嘧啶反應率最低）和SCS3（腸內分泌細胞和2型小球細胞豐度最低，氟尿嘧啶反應率最高）之間的DEGs，然后得到DEGs與CRISPR文庫篩選的潛在驅動基因組的交叉點。結果確定了七個核心基因，其sgRNA在氟尿嘧啶處理的存活細胞群中明顯增加，并且在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中SCS2亞型的表達明顯增加（圖8A-C）。定義了一個名為CRISPR評分的新變量，其數值是通過對這七個基因的表達值進行加總而得到的。相關分析顯示（圖8D-G），CRISPR評分也與GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中的腸內分泌細胞、亞型2腺細胞、多種基質和骨髓細胞以及基質途徑的PCA評分、氟尿嘧啶反應的估計AUC和SCS評分值明顯正相關。臨床分析進一步表明，在接受ADJC的患者中，CRISPR分數高的患者比CRISPR分數低的患者表現出較差的預后（CRISPR分數作為一個連續變量進行分析，圖8H）。同樣，還發現，ADJC的表現增加了高CRISPR評分亞組的死亡風險（圖8I）。總之，根據這些真實世界隊列的分析結果，認為這七個基因可能以高度協調的方式驅動SCS2患者的化療抵抗。

????????由于單純的化療可能無法使腸道內分泌細胞和2型腺細胞富集水平高的患者受益，作者探討了可用于SCS2亞型患者的化療增敏的潛在化合物。通過分析CTRP數據庫中化合物的AUC與GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中SCS評分之間的相關性，確定了19個化合物，其與SCS評分的相關系數在三個隊列中同時小于-0.5（圖8J）。對這些化合物的基因靶點（圖8K，頂部）和活性（圖8K，底部）的進一步分析表明，有6個是PI3K激酶家族成員的抑制劑。其中，XK765針對多種PI3K催化亞基；TGX-221和AZD6482都能抑制PIK3CB的活性，而AZD6482、CAL-101和TG-100-115主要抑制PIK3CD的活性。這些發現為開發SCS2患者有效的化學增敏治療策略提供了一個新的視角。

圖8 篩選驅動基因和候選目標或化合物

四、結論

????????該研究全面揭示了與分泌細胞標志物轉錄表達富集有關的臨床行為、TME和生物學行為的異質性。此外，SCS評分是一個容易獲得的模型，可用于識別SCS2患者，這是一組具有特殊臨床特征的患者。