今天的內容，真的是不求甚解。。以下內容參考至生信星球和劉小澤-測序的世界。http://www.lxweimin.com/p/101c14c3a1d2
區分一二三代測序
一代測序：Sanger法測序
圖片引用自劉小澤，測序的世界。http://www.lxweimin.com/p/101c14c3a1d2
聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來，測序分為四個反應容器，每個容器加入四種核糖核苷酸dNTP和某一種雙脫氧核糖核苷酸ddNTP，DNA合成的時候就會隨機的引入這種雙脫氧核糖核苷酸，從而不能繼續合成，這樣DNA片段就到這個位置終止。通過電泳，就可以將四條泳道的DNA產物按照大小分開，根據模板DNA合成的序列就可以從下向上一次讀出，如上圖圖所示，序列為TACTGACTCG
二代測序
如Illumina，可有4個主要步驟：原理介紹視頻：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密碼： 密碼：bxsry4
1.Sample preparation
2.Cluster generation
3.Sequencing
4.Data analysis
1.Sample preparation
超聲波將DNA分子打斷成300-800bp長序列片段（人類基因組打成300-500bp），用酶補平為平末端，然后3‘端加一個A堿基（因為接頭的3‘端有一個突出的T），再在兩端加上互補配對的adapter，再通過PCR擴增達到一定濃度，構成單鏈DNA文庫。
作者：劉小澤
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- 2.Cluster generation
flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，測序就在此進行。Flowcel上面連有兩種接頭（P5、P7），當DNA經變性后流經Flowcell時，利用Flowcell上的接頭與DNA兩端的接頭相互匹配。DNA進行橋式PCR擴增，從而將堿基信號放大上面構建好的文庫中的待測序列事先配置好一定的濃度，經過這里的時候，會在特異的化學試劑作用下，強力隨機地附著在lane上，與上面的短序列配對。上樣的結果就是lane吸附住了沖過來的DNA，并且可以在表面進行橋式PCR擴增。
橋式PCR： PCR彎成橋狀，一輪橋式擴增一倍
循環： 大約35個循環后，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，稱為cluster，這是一群完全相同的序列。目的在于實現放大單一堿基的信號強度，滿足后期測序需求
作者：劉小澤
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- 3.Sequencing
分三步：DNA聚合酶聚合帶熒光且具有保護基團的NTP（可終止反應），熒光標記簇成像，保護基團被切除進行下一個循環
illumina采取了“一次加一個熒光堿基，用完失效”的辦法。illumina的測序就是在Sanger基礎上加上了橋式PCR，能克服Sange低通量的缺點
三代測序
又被為"Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing"（單分子實時DNA測序技術），該方法基于納米孔的單分子讀取技術，不需要擴增即可快速讀取序列，解決了初始模板DNA擴增的偏好性問題。它也采用邊合成邊測序方法，以SMRT芯片為測序載體，芯片上眾多小孔中的DNA聚合酶和模板結合，4色熒光標記4種堿基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在堿基配對階段，加入不同堿基會發出不同的光，根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。
有人說三代準確率低，又有人說非常高？
目前的幾種技術：
- PacBio 實時單分子測序
- 2.Complete Genomics公司的復合探針-錨定連接技術
- 3.Oxford Nanopore 納米孔單分子通道技術
- 4.Ion Torrent電子流檢測技術
NGS組學（摘自生信星球）
1.基因組學（核酸序列分析）
（1）全基因組測序（WGS）
（2）全外顯子組測序（WES）
（3）簡化基因組測序（RRGS）
①RAD-Seq
②GBS
③2bRAD
④ddGBS（也就是ddRAD）
作用：
（1）基因組作圖（遺傳圖譜、物理圖譜、轉錄本圖譜）
（2）核苷酸序列分析
（3）基因定位
（4）基因功能分析
2.轉錄組學（基因表達分析）
（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（長鏈非編碼RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）
3.蛋白質組學
（1）蛋白質組數據處理、蛋白及其修飾鑒定
（2）構建蛋白質數據庫、相關軟件的開發和應用
（3）蛋白質結構功能預測
（4）蛋白質連鎖圖
4.代謝組學
（1）代謝物指紋分析
（2）代謝輪廓分析
測序發展簡史
