Tumors attenuating the mitochondrial activity in T cells escape from PD-1 blockade therapy
今天跟大家分享日本慶應大學醫學院去年3月發表在Elife上的一篇7.08分文章，探討關于腫瘤對PD-1免疫治療耐藥的機制。
文章摘要：當前最熱門的免疫治療藥物——靶向PD-1受體的抑制性抗體，其治療原理是通過阻斷癌細胞表面PD-1或PD-1配體，使T細胞重新識別和殺滅腫瘤，但是這種療法只有不到一半的癌癥患者有效。作者提出兩種導致免疫治療無效的假設：癌細胞可能通過干擾T細胞的線粒體功能，或提高癌細胞表面的MHC I類蛋白表達來逃脫PD-1阻斷治療。對此，作者在小鼠中開發了一種雙側腫瘤模型用來測試腫瘤是否釋放了免疫抑制因子：一側接種對PD-1阻斷免疫治療敏感腫瘤，另一側接種免疫治療不敏感腫瘤。如果不敏感的腫瘤只是躲避傳代的T細胞，它的存在就不會影響其他腫瘤。但是，如果不敏感腫瘤正在釋放阻止T細胞活化的分子，那么另一個腫瘤也可能對PD-1阻斷治療不敏感。通過這種動物模型，作者將不敏感的腫瘤進一步分為兩組：一組只是對局部的T細胞隱藏自己，而另一組釋放分子可以抑制全身的T細胞。這些抑制因子的成分尚不清楚，但進一步的實驗表明它們可能通過阻斷T細胞中的線粒體起作用，采用增強線粒體活性的藥物可以使抗PD-1治療不敏感的腫瘤恢復敏感性。
1. 根據免疫治療的療效，將腫瘤分為敏感腫瘤和不敏感腫瘤
研究者首先使用抗PD-L1單克隆抗體或Pdcd1 -/-小鼠模型，阻斷PD-1信號，來確定哪些腫瘤細胞株PD L1抗體敏感/響應和不敏感/不響應（圖1），MC38、GL261和MethA為敏感/響應（responsive）腫瘤，而B16、LLC、Pan02和CT26為不敏感/不響應（Unresponsive）腫瘤。
由于CD8?+細胞毒性T淋巴細胞（CTL）是PD-1阻斷療法期間的主要效應細胞，因此作者按照圖2中所示的周期，對宿主敏感腫瘤和不敏感腫瘤的T細胞進行檢測圖2A。他們發現在敏感腫瘤組中，淋巴結（DLNs）中的總淋巴細胞和效應記憶性CD8?+?T細胞（CD62L?lowCD44high，P3）均顯著增加，但在不敏感的腫瘤組在PD-1阻斷后，CD8 + T細胞沒有變化（圖2B和C）。此外，和ctrl IgG治療組相比，PD-1阻斷治療后，敏感腫瘤組比不敏感腫瘤組的中央記憶T細胞（CD62L高CD44高，P2門）和效應記憶T細胞（CD62L低CD44高，P3門）更多。
在敏感腫瘤組中，PD-1阻斷后，CD8?+腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）也增加了（圖2D），Th1型細胞毒活性的T-bet和IFN-γ的表達增加（圖2E和F），但在不敏感腫瘤組中則沒有。在具敏感性腫瘤的組中，PD-1阻斷治療后，反映而在不敏感性腫瘤組中則沒有。在另一種遺傳背景（BALB / c）的小鼠中也獲得了類似的結果（參見原文）。綜上，根據抗腫瘤免疫治療的療效，將腫瘤分為敏感腫瘤和不敏感腫瘤。
2. PD-1阻斷后敏感腫瘤小鼠的效應CD8 + T細胞具有更高的線粒體活性
由于CD8 + T細胞中的線粒體激活是CTL激活的標志物。因此，為了確定對PD-1阻斷療法的敏感與T細胞中的線粒體活化之間是否存在關聯，我們使用Seahorse Analyzer（圖2-圖補編1A）。我們發現來自敏感（MC38和GL261）腫瘤宿主的DLN CD8 + T細胞具有較高的基礎呼吸，最大呼吸，備用呼吸能力（SRC）和受PD-1阻斷的ATP轉換，這在不敏感者中未觀察到（B16和LLC）荷瘤宿主（圖3A）。在BALB / c背景下的小鼠中獲得了相似的結果。此外，PD-1阻斷療法僅對敏感能力的荷瘤小鼠增加CD8 + TIL中線粒體超氧化物的產生（MitoSox）和細胞ROS（CellRos）（圖3B和C）。因此，PD-1阻斷在具有響應能力的荷瘤小鼠中CD8 + T細胞的活性增加，與線粒體的激活有正相關。
3.根據是否存在全身免疫抑制特性（SIP）對不敏感的腫瘤進行分類
為了研究全身免疫抑制不敏感性腫瘤的機制，將不敏感性和敏感腫瘤分別接種在宿主的雙側（圖4A）。發現當左側不敏感的腫瘤（LLC或Pan02）存在時，PD-1阻斷療法對右側敏感MC38的生長抑制效率低下（圖4B）。但是，當不敏感的B16位于左側時，敏感的MC38或GL261被PD-1阻斷療法抑制，與左側沒有腫瘤的時候一樣有效（圖4B）。PD-1阻斷療法未抑制同一實驗中左側不敏感腫瘤的大小（參見原文）。因此，我們推測不敏感的LLC和Pan02腫瘤可能釋放了免疫抑制因子，而不敏感的B16沒有。
按照相同的實驗設計，我們在另一背景（BALB / c）的小鼠中進行了雙邊腫瘤實驗，并確定CT26是SIP的不敏感性腫瘤（圖4C ）。綜上所述，我們將不敏感的腫瘤分為兩組：有或沒有全身免疫抑制特性（systemic immunosuppressive property，SIP）的腫瘤（表1）。
4.腫瘤來源的抑制性可溶性因子體內抑制T細胞的線粒體活性
繼續用雙側腫瘤模型從線粒體激活的角度研究了左側的不敏感性腫瘤釋放的免疫抑制因子如何抑制右側敏感性腫瘤的免疫應答（圖5A）。如圖5B所示，通過PD-1阻斷，在另一側SIP陰性B16的小鼠中，MC38一側的DLN中淋巴細胞的絕對數量增加，而在SIP陽性LLC在另一側時，則沒有。因此，在另一側有B16的情況下，在MC38一側存在PD-1阻斷作用，DLN CD8 + T細胞中的線粒體ROS產生、耗氧率OCR和ATP轉化也得到了增強，但當SIP陽性LLC發生時，情況并非如此。接種在另一側（圖5C和D）。相比之下，PD-1阻斷治療并未改變不敏感的腫瘤側（B16和LLC）的線粒體激活狀態（圖5E和F）。總之，盡管LLC和B16均不敏感，但在PD-1阻滯治療期間可抑制全身的T細胞線粒體活化。
5.免疫治療無效的B16腫瘤誘導了局部免疫耐受
我們懷疑沒有SIP的不敏感腫瘤可能無法通過獲得性免疫識別。我們比較了野生型和免疫缺陷小鼠（Rag2 -/-）之間的腫瘤生長。如圖所示圖6A與Rag2 -/-小鼠相比，野生型小鼠的敏感腫瘤（MC38，GL261和MethA）的生長顯著被抑制。相反，不敏感的腫瘤或多或少對獲得性免疫不敏感（圖6B）。雖然SIP陽性的不敏感性腫瘤（LLC和CT26）可以被獲得性免疫發現，但SIP陰性的不敏感性腫瘤（B16）被完全忽略（表1）。可能是由于腫瘤的抗原較少和/或缺乏MHC I類表達產生的免疫耐受。甚至在受到IFN-γ刺激后，B16也不表達I類MHC，但SIP陽性腫瘤卻表達了（圖6C和D）。換句話說，B16通過采用局部免疫耐受而不是SIP導致不敏感。
這些數據表明在SIP陰性的腫瘤中不敏感性的機制之一是缺乏I類MHC表達，并且表明抑制因子的消除僅在具有SIP的不敏感性腫瘤中促進PD-1阻斷治療功效的增強。
6.SIP陽性腫瘤的免疫抑制性小分子的分泌
T細胞增殖：為了檢查不敏感的腫瘤是否釋放免疫抑制因子，在從敏感和不敏感性腫瘤細胞培養物中收集到的上清液存在的情況下，用抗（CD3 + CD28）mAb包被的珠子刺激了未成熟的CD8+?T細胞（圖7A）。增殖測定（胸苷摻入和Ki67檢測測定）表明，在LLC或CT26的上清液存在下，T細胞增殖受到顯著抑制，而在B16，GL261或MethA的上清液存在下則沒有（圖7B 和 圖7－圖補編1A和B）。稀釋上清液后恢復T細胞增殖，進一步證明了LLC上清液中可溶性因子的抑制作用（參見原文）。并且，不但部分小鼠細胞系有SIP因子陽性，而且部分人細胞系也有（參見原文）。
T細胞線粒體：此外，與B16和GL261上清液相比，LLC上清液可顯著抑制線粒體的ROS和線粒體電位（圖7C）。與B16和GL261相比，在LLC上清液存在下培養48小時的CD8+T細胞中，氧消耗率OCR和糖酵解——細胞外酸化率（ECAR）顯著降低（圖7D和E）。為了闡明這種線粒體抑制是直接抑制還是間接抑制，T細胞與LLC上清液的共培養2小時，線粒體的激活參數被立即抑制（圖7F）。SIP因子可以在2小時內抑制B細胞的線粒體，顯示出這種抑制作用是廣譜的（圖7補充圖3B）。這些結果表明，從SIP陽性腫瘤中釋放的免疫抑制因子可直接抑制線粒體功能。
為了了解抑制因子的分子特性：作者用熱滅活處理使蛋白質成分變性，并采用了葡聚糖包被的木炭（DCC）處理來吸附培養物上清液中的小分子。如圖所示圖7G 和 圖7－圖補遺1E，LLC和CT26培養上清液的熱失活并未消除其抑制活性，而使用DCC處理去除低分子量化合物則消除了其抑制活性，這表明抑制因子可能由非蛋白質小分子組成。我們進一步將上清液分為'A級組分（<3 KDa）'和'B級組分（3-50 KDa）'，發現'小分子組分A'具有與總培養上清液幾乎相同的抑制效果（圖7H ）。同樣，使用DCC處理從“組分A”中除去小分子可恢復CD8+T細胞的增殖。我們進一步測試了先前報道的小分子是否可以作為SIP因子的候選物，例如腺苷，前列腺素E2（PGE2）和犬尿氨酸，檢查了產生它們的關鍵酶的轉錄水平。但是，抑制特性與包括CD39，CD73，COX-2，mPGES1和IDO1在內的酶的表達水平沒有關系（參見原文），表明這些已知的小分子可能不是抑制作用的關鍵因素。
7.苯扎貝特與PD-1阻斷劑的組合可改善患有SIP陽性腫瘤的小鼠的存活率
作者進一步在體外驗證線粒體激活藥物苯扎貝特是否可以逆轉SIP陽性腫瘤的免疫抑制作用。實驗發現，苯扎貝特可以逆轉體外LLC培養上清液中抑制因子對未成熟的CD8 + T細胞線粒體抑制，線粒體功能得到了顯著恢復（圖8A）。此外，體內實驗對LLC荷瘤小鼠采用苯扎貝特和PD-1阻斷聯合治療（圖8B）可增強對LLC腫瘤的療效（圖8C）。不過聯合治療無法增強對B16腫瘤的療效（圖8C）。我們在BALB / c背景下的腫瘤中觀察到了相似的結果（結果參見原文）。因此，體外和體內實驗共同表明，通過線粒體活化化學物質苯扎貝特可增強SIP陽性的不敏感性腫瘤的療效。
點評
這篇文章作者巧妙的設計雙側不同腫瘤實驗，將腫瘤分為有或沒有釋放免疫抑制因子誘導免疫耐受的腫瘤。不過免疫抑制因子的機制探討部分，對T細胞線粒體的抑制功能并不明顯。因此針對線粒體激活功能的藥物聯合使用并沒有明顯增強療效。
