轉錄組分析是生信分析的一個基礎和常見的分析流程，一般從下機數據開始，經過一系列的質控，基因組比對，差異分析等過程得到實驗組與對照組（或者腫瘤中的轉移組和原癌組）中差異表達的基因集，然后在基于該基因集結合我們的研究方向進行進一步的功能分析，信號通路分析，細胞間通訊，實驗驗證等得到一個可解釋的實驗結果。這篇文章主要就涉及到的基本流程和相應軟件進行一個簡單的介紹，后續更深入的知識點還需要小伙伴們自己去挖掘哦。
基本分析流程：
- 原始數據 -- Rawdata
- 質控 -- QC -- Trimmomatic，FastQC
- 基因組比對 -- Aligment -- STAR
- 比對結果量化 -- FeatureCount -- featurecount
- 兩組間的基因表達差異分析 -- DEGs -- limma
- 差異基因的功能富集分析 -- GO,KEGG -- clusterProfiler
一. 測序數據下機后處理
首先，我們拿到的原始序列文件就是fq.gz 文件
-
一般研究人員會把自己的樣本（實驗組/對照組）送到測序公司進行測序，然后測序公司會返回給我們一個fq.gz文件，如下. 每個樣本都有兩條鏈的測序數據 *_1.fq.gz 和 *_2.fq.gz ， 我們要把他們單獨放在一個文件夾下作為一個樣本進行后續分析。
fq.gz.png
1.下載fastq.gz rawdata
wget url
2.每個樣本創建一個以樣本名命名的文件夾（eg RNA-1）, 并將相應的._1.fq.gz/._2.fq.gz 放入文件夾（eg RNA-1），用作后續QC處理。
mkdir sample1 sample2 sample3 control1 control2 control3
for samp in {sample1 sample2 sample3 control1 control2 control3}
do
mv "../rawdata/*"$samp"*_1.fq.gz" $samp
mv "../rawdata/*"$samp"*_2.fq.gz" $samp
done
二. 低質量數據過濾和質量評估QC -- Trimmomatic/FastQC
1. Trimmomatic
Trimmomatic: A flexible read trimming tool for Illumina NGS data
- 因為公司給的數據里面，是沒有去掉接頭的，所以需要跑之前先把接頭去掉，過濾質量后再用。
使用Trimmomatic(或者Trim Galore)切除數據中的接頭序列和低質量序列，專門清洗illumina測序數據的常用工具
優點：
1、可直接對.fq.gz壓縮文件操作
2、結果默認生成在同文件的目錄下，不生成文件夾，直接生成四個*.fq.gz文件。若需要有文件夾，需要額外建立文件夾的指令。參數-o,為文件夾（文件）
trim_result.png
Trimmomatic的執行文件是一個Java文件
### 切除接頭序列
java -jar /home/Software/Trimmomatic-0.39/trimmomatic-0.39.jar \
PE \ # rawdata為雙端測序
-phred33 \ # Fastq文件的質量值格式
-threads 6 \ # 6 線程
-trimlog Trimmomatic.log \ # 日志文件保存位置
$read1 $read2 \ # *_1.fq.gz, *_2.fq.gz 需要過濾的Fastq文件
$trim_read1 \ # *_1.clean.fq.gz 過濾后的Fastq文件
output_unpaired_1.fq.gz \ # read1的5‘->3'和read2的3‘->5'未能匹配上的Fastq文件
$trim_read2 \
output_unpaired_2.fq.gz \
ILLUMINACLIP:/home/Software/Trimmomatic-0.39/adapters/TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:1:TRUE \ # 去除illumina測序平臺下的TruSeq3接頭序列，不知道可以問測序公司。
# 2:30:10即表示，在比對接頭序列時允許有兩個位置的堿基發生錯配，雙端測序的兩條reads與接頭序列匹配率超過30%的話，就會被切除掉，單條reads如果與接頭序列的匹配率超過10%，也會被切除掉。
LEADING:0 \ # 切除reads 5’端質量值低于0的堿基, 即不對5’端剪切
TRAILING:25 \ # 切除reads 3’端質量值低于25的堿基
SLIDINGWINDOW:50:25 \ #以50bp為窗口進行滑窗統計，切除堿基平均質量低于25的窗口及之后的序列。
MINLEN:50 \ #去除過濾后長度低于50的reads
HEADCROP:0 \ # 切除reads開頭的0個堿基
2>trim.log 1>trim.err # 0 表示stdin標準輸入；1 表示stdout標準輸出；2 表示stderr標準錯誤
使用參數
- PE/SE
rawdata為 Paired-End，還是 Single-End的reads，其輸入和輸出參數稍有不同。 - -threads
設置多線程運行數 - -phred33
設置堿基的質量格式，可選pred64 - ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10
切除adapter序列。參數后面分別接adapter序列的fasta文件：允許的最大mismatch數：palindrome模式下匹配堿基數閾值：simple模式下的匹配堿基數閾值。 - LEADING:3
切除首端堿基質量小于3的堿基 - TRAILING:3
切除尾端堿基質量小于3的堿基 - SLIDINGWINDOW:4:15
Perform a sliding window trimming。Windows的size是4個堿基，其平均堿基質量小于15，則切除。 - MINLEN:50
最小的reads長度 - CROP:
保留reads到指定的長度 - HEADCROP:
在reads的首端切除指定的長度 - TOPHRED33
將堿基質量轉換為pred33格式 - TOPHRED64
將堿基質量轉換為pred64格式
2.FastQC (測序數據質控)
- FastQC 是高通量測序數據的高級質控工具，輸入FastQ，SAM，BAM文件，輸出對測序數據評估的網頁報告。
一般在Trimmomatic之后，用FastQC軟件對預處理數據進行質量控制分析。
優點：
1、可直接對.fq.gz壓縮文件操作
2、結果默認路徑生成在同文件的目錄下，生成的文件夾為XX_fastqc,里面有fastqc_data.txt , fastqc_report.html等重要文件
fastqc $trim_read1 $trim_read2
fqc.trim.png
fqc_detail.trim.png
3、可生成在指定的文件夾（應該說是路徑吧），需要額外建立文件夾，用-o參數，為文件夾（文件）
fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq
使用說明 - -t --threads:線程數
- -o --outdir:輸出路徑
- --extract：結果文件解壓縮
- --noextract：結果文件壓縮
- -f --format:輸入文件格式.支持bam,sam,fastq文件格式
結果解讀
我們對Trim過濾之后的序列進行質量評估，評估結果如下：
FastQC 會生成一個fastqc_report.html的結果報告，下面是軟件對質控結果進行判斷：綠色代表PASS；黃色代表WARN；紅色代表FAIL
簡單說一下報告中常見的幾張圖吧
-
每個堿基位置的質量分數分布圖
image.png
橫軸為read長度，縱軸為質量得分。說明trim后的Reads質量較高，可以用于后續分析。
一般要求所有位置的10%分位數大于20，即大于最多允許該位置10%的序列低于Q20。綠色區域說明數據質量較高。一般但隨著測序長度的加深，堿基的錯賠率會增加。
-
平均質量分數分布圖
image.png
橫軸表示Q值，縱軸表示每個值對應的read數目，當測序結果主要集中在高分中，證明測序質量良好
-
每個堿基位置的堿基N百分比
image.png
N占比越低，數據質量越高
-
序列的核酸組成偏好性
image.png
正常情況下，我們期望的是A=T=C=G，GC含量較高時，經常會出現A=T,C=G的情況。
-
每條reads的GC占比
image.png
GC含量-GC含量對應的read數。藍色為經驗分布給出的理論值，紅色是測序數據的真實值，但兩條線接近重合時，說明數據質量較高；當紅色出現雙峰可能是樣品被污染或不純。
-
重復reads統計
image.png
橫軸表示重復的次數，縱軸表示重復的reads的數目
其他更多信息可以去官網自行查看。
三. Clean reads的基因組比對 Aligment -- STAR
針對每個樣本，利用 STAR軟件 將預處理序列與測序物種的參考基因組序列進行序列比對。
1. 比對原理
將QC后的reads比對到參考基因組上，一般分為有參考基因組比對和無參考基因組比對。我們常用的就是有參考基因組的比對。
- 如果數據庫中存在該物種的物種基因組（fasta）及其基因組注釋文件（gff, gtf），那么，我們就可以用該基因組信息作為參考基因組進行clean reads序列比對，便可以知道基因組的哪些位置轉錄了RNA序列，通過對reads進行計數，而得到基因表達的定量數據。
- 如果沒有可用的參考基因組及其注釋信息，則需要考慮無參考基因組的比對方法進行比對。首先先將reads 進行組裝拼接，得到從頭組裝的組裝轉錄本，然后再將clean reads比對到組裝轉錄本上得到比對結果。
在參考基因組比對的時候，會優先考慮大片段比對，如果比對不上，再考慮將片段切割成不同區段進行比對。
RNAseq 常用的比對工具有：Hisat2, STAR 等
2. STAR 比對
STAR
--runThreadN 20 \ # 線程數
--genomeDir /home/database/ref \ # 參考基因組
--readFilesCommand gunzip -c \ # *.gz 文件解壓縮
--readFilesIn *_1.fq.gz *_2.fq.gz \ #輸入文件，空格隔開
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ # 輸出bam文件（默認輸出sam文件）
--outFileNamePrefix Aligment \ # 輸出文件的位置和前綴
結果解讀
- 比對結果：Aligned.out.sam或者Aligned.out.bam
- 比對完以后的統計信息： Log.final.out
- 剪切的信息：SJ.out.tab
BAM/SAM文件
bam是sam的壓縮格式，在內容上是一樣的，linux下可使用samtools, bamtools 進行查看與轉換。
bam文件分為2個部分，header和record.
- header,以@開頭，包含：
@HD 版本信息；
@SQ 比對參考序列信息；
@RG 測序平臺信息；
@PG 序列比對使用的軟件信息 -
record為基因組比對信息，每一行信息為：
reads ID
比對到基因組上的信息
比對到的染色體
比對上的位置信息
比對質量值
堿基組成
堿基質量值等
bam.png
比對率統計
總比對率和唯一比對率是我們關注的，尤其是總比對率。
- 總比對率低，一般可分為2種情況，總比對率低于10% ，可能是弄錯了物種來源，比如鼠源細胞當成了人源的；總比對率低于60%，說明有外源基因組的污染，最常見的就是細胞培養的時候受到支原體污染。
比對區域分布統計
比對reads在每條染色體上的密度分布情況
可以通過IGV軟件可視化查看BAM文件信息
具體以后再詳細展開……
四. 比對結果的外顯子（基因）表達計數 FeatureCount -- featurecount
在高通量測序分析中用于下游分析的關鍵信息是比對到每個genomic feature（外顯子的表達量、featurecounts是一款使用于RNA-seq和DNA-seq的read summarization工具，應用了高效率的染色體哈希算法和feature區塊技術因等）中的read數目。
featurecounts 速度快，需要的內存空間少，同時可以用于單端和雙端的數據
通過STAR等軟件比對得到的BAM文件，利用計數軟件（如 featurecount, HTseq, stringtie），獲取各基因的 reads count。
假設前提：認為比對到基因的reads 數與該基因的表達量成正相關。
featurecount的調用方法
/home/Software/featureCounts \
-T 4 \ # 線程數目，1~32
-a $gtf \ # 參考gtf文件
-o read.count \ # 輸出文件的名字，輸出文件的內容為read 的統計數目
-p \ # 只能用在paired-end的情況中，會統計fragment而不統計read (-p -B -C 同時使用、不使用)
-B \ # 在-p選擇的條件下，只有兩端read都比對上的fragment才會被統計
-C \ # 如果-C被設置，那融合的fragment就不會被計數，這個只有在-p被設置的條件下使用
-t exon \ # 設置feature-type，-t指定的必須是gtf中有的feature，同時read只有落到這些feature上才會被統計到，默認是“exon”
-g gene_name \ # 默認為gene_id，注意！選擇gtf中提供的id identifier！！！
-s 2 \ # 2條鏈比對
Align.sorted.bam # 輸入的bam/sam文件，支持多個文件輸入
得到read.count數據之后，還需要進行進一步處理才能夠進行分析。
由于實驗中每個樣本的上樣量不同，或者基因的長度,測序深度不同等導致基因count本身就存在著較大差異，所以，我們是不能夠直接只用count 數據進行后續的基因表達差異分析的。因此我們需要對 count 數據進行標準化。
countToFpkm <- function(counts, effLen) {N <- sum(counts)
exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) )}
轉錄本表達量計算采用FPKM計算度量指標(FPKM- Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)。FPKM含義是以每百萬比配成對序列每1Kbp長度做轉錄本表達量指標，其中轉錄本長度和總比配成對read數目用于歸一化表達量數值。用cuffnorm程序分別計算各個樣本FPKM表達量取log2。
五. 不同分組間的基因差異表達分析 DEGs -- limma
根據樣本的實驗設計，利用limma包對不同樣本組之間篩選差異表達的已知轉錄本。滿足pvalue <= 0.05和大于等于2倍差異表達范圍篩選兩組之間的差異轉錄本
差異基因可視化 -- 火山圖
針對組間篩選的不同差異基因集， 采用venn方法進行共同和特有的比較分析
針對樣本組間篩選的差異表達基因， 采用對基因和樣本進行雙向層級聚類并且用熱圖顯示
六. 差異基因的功能富集分析 -- GO,KEGG
拿到差異基因之后，需要將這些基因從微觀映射到宏觀，從分子表達水平上升到功能分析，這樣也具有更好的解釋性。GO和KEGG就是基于不同的分類思想而儲存的基因相關功能的數據庫。
- GO和KEGG是兩個數據庫，里面有每個基因相關的功能信息，而富集分析就是一個把這些功能進行進行整合計算的算法。
- GO和KEGG富集的R包clusterProfiler
1. GO功能分析
GO功能分析是針對全基因/轉錄本和差異基因/轉錄本進行功能注釋和歸類。GO數據庫，全稱是Gene Ontology(基因本體)，他們把基因的功能分成了三個部分分別是：細胞組分（cellular component, CC）、分子功能（molecular function, MF）、生物過程（biological process, BP）。利用GO數據庫，我們就可以得到我們的目標基因在CC, MF和BP三個層面上，主要和什么有關。
library(clusterProfiler)
ego<-enrichGO(gene=genelist,OrgDb="org.Hs.eg.db",minGSSize = 2,keyType = "ENTREZID",ont ="ALL",pvalueCutoff = 0.1, readable=TRUE)
write.table(ego@result,"GO_enrichment.xls",row.names=F,quote=F,sep="\t")
條形圖可以顯示，DEGs中的差異基因都顯著富集到了哪些通路上面。
還可以更詳細地查看通路富集情況
2.KEGG富集通路分析
KEGG數據庫：除了對基因本身功能的注釋，我們也知道基因會參與人體的各個通路，基于人體通路而形成的數據庫就是通路相關的數據庫。而KEGG就是通路相關的數據庫的一種。其實通路數據庫有很多，類似于wikipathway，reactome都是相關的通路數據庫。只是因為KEGG比較被人熟知，所以基本上都做這個分析的.
library(clusterProfiler)
kk<-enrichKEGG(gene=genelist,organism='hsa',keyType="ncbi-geneid",pvalueCutoff = 0.05,pAdjustMethod = "BH", minGSSize = 2, maxGSSize = 500,qvalueCutoff = 0.2, use_internal_data = FALSE)
res_pathview<-kk@result
kk<-setReadable(kk,OrgDb="org.Hs.eg.db",keyType="ENTREZID") ###mapping gene id to gene symbol
res<-kk@result
colnames(res)[1]<-"pathwayID"
write.table(res,"KEGG_enrichment.xls",quote=F,row.names=F,sep="\t")
富集通路的條形圖，可以顯示差異基因富集到的通路有哪些。
