這是我聽孟浩巍知乎LiveB站鯪魚不會(huì)飛視頻（轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)階課程）里的筆記哦~

本次知乎Live解決的問(wèn)題：

轉(zhuǎn)錄組的建庫(kù)與質(zhì)量控制

• 人類基因組與轉(zhuǎn)錄組組成
• 轉(zhuǎn)錄組的2種建庫(kù)策略
• 轉(zhuǎn)錄組的分鏈建庫(kù)策略
• 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用 single end 還是 pair end？
• 建庫(kù)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的質(zhì)控策略

轉(zhuǎn)錄組的比對(duì)與定量策略

• 常用比對(duì)策略介紹：bowtie, Tophat, STAR, HISAT
• 選擇合適的參考基因組（hg19 / hg38）
• 確定基因表達(dá)量的若干策略：Raw Count, RSEM, FPKM, RPKM, TPM
• 基于FPKM的差異表達(dá)分析流程
• 基于 Raw Count 的差異表達(dá)分析流程

上機(jī)操作部分

使用 Python 與 R 搭建基于 Raw Count 的分析流程

導(dǎo)言

轉(zhuǎn)錄組分析的核心是找差異
找不同實(shí)驗(yàn)條件下、不同處理下、不同情況下基因表達(dá)量的差異、可變剪切的差異、基因融合的差異......

• 基因表達(dá)定量 ---> 差異表達(dá)基因（想要找差異表達(dá)基因那首先要確定基因的表達(dá)量）
• 可變剪切定量 ---> 可變剪切差異

所以說(shuō)高通量分析轉(zhuǎn)錄組的核心就是選擇一種更準(zhǔn)確更快的方法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行定量從而找出差異基因。

測(cè)序之前要先建庫(kù)，所以后續(xù)我們會(huì)討論建庫(kù)的方案。

拿到測(cè)序數(shù)據(jù)后，第一步先做質(zhì)控；第二步把質(zhì)控后的序列回帖到參考基因組，這步就需要考慮回帖的時(shí)候用什么軟件什么策略更準(zhǔn)確；第三步，回帖到參考基因組后怎樣衡量基因表達(dá)量是高還是低；第四步，找可變剪切找差異表達(dá)基因。

中心法則

在細(xì)胞運(yùn)行過(guò)程當(dāng)中RNA起到非常重要的作用，當(dāng)然最主要的研究最多的是RNA的信息傳遞的作用。

我們的轉(zhuǎn)錄組分析其實(shí)就是分析這些RNA，其中最主要的是分析mRNA，但是除了mRNA之外的少量的其他種類RNA還有很多未知，更加值得進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘。當(dāng)然在眾多種類的RNA中我們的mRNA是一個(gè)典型的代表，所以在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)階的時(shí)候我們以mRNA為例。

人類基因組與轉(zhuǎn)錄組組成

在認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)錄組之前首先要認(rèn)識(shí)一下基因組，因?yàn)橹行姆▌t告訴我們RNA是來(lái)自于DNA的：

• 人類有46條染色體：22 * 2 + X + Y
• 人類基因組有兩部分組成：細(xì)胞核基因組 和 線粒體基因組
• 我們常說(shuō)的基因組是細(xì)胞核基因組大概有3.1Gb，線粒體基因組有16.6Kb
  Human genome ：3.1 Gb
  chrM : 16.6Kb
• 常用的基因有27000左右個(gè)（兩萬(wàn)七千個(gè)常用的基因）
  其中編碼蛋白質(zhì)的有兩萬(wàn)個(gè)左右；能轉(zhuǎn)錄成有功能的RNA的基因有七千個(gè)左右
  20000個(gè)左右蛋白基因
  7000個(gè)左右RNA gene
• 人類線粒體基因組中總共有37個(gè)基因，其中 22個(gè)tRNA基因；2個(gè)rRNA基因；13個(gè)編碼蛋白的基因

RNA的種類與目前注釋情況

RNA的種類與目前注釋情況

左邊這個(gè)餅圖基本上就覆蓋了所有注釋好的RNA，只要做小RNA的分析基本上是不可能逃過(guò)這些數(shù)量的，這要超過(guò)這些數(shù)量就有預(yù)測(cè)的成分了。

我們知道RNA有很多種類，每種RNA的含量大概是多少呢？下圖的文獻(xiàn)給我們做了非常好的總結(jié)。

rRNA也就是核糖體RNA占80%-90%，剩下的10%-20%絕大多數(shù)是tRNA，真正的我們所專注的 mRNA 只占5%左右。

RNA在細(xì)胞中的絕對(duì)數(shù)量

我們提取出的RNA絕大部分是rRNA但我們真正關(guān)注的卻是mRNA，此時(shí)我們應(yīng)該富集，所以說(shuō)轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)的核心就是將目標(biāo)RNA比例提高。（常見的就是富集mRNA）

轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)的核心

• 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)的核心是把目標(biāo)RNA（最常見的是mRNA）的比例提高，然后進(jìn)行擴(kuò)增，使其濃度達(dá)到可以建庫(kù)測(cè)序的要求。
• 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的核心，就是通過(guò)特殊的擴(kuò)增方法，只擴(kuò)增mRNA而不擴(kuò)增其它種類的RNA，然后進(jìn)行測(cè)序。

轉(zhuǎn)錄組的2種建庫(kù)策略

• 第一種是正選擇 —— polyA positive
• 第二種是負(fù)選擇 —— rRNA minus

RNA-Seq的建庫(kù)方法—怎樣富集mRNA

• polyA positive 建庫(kù)方法
  人的成熟的mRNA含有polyA尾巴，用Oligo dT（帶有一段T序列的磁珠）標(biāo)簽去拉polyA尾巴，就會(huì)把mRNA從眾多種類的RNA中拉出來(lái)，這種富集mRNA的方法就是polyA positive 建庫(kù)方法。

• rRNA minus 建庫(kù)方法
  我們知道細(xì)胞中rRNA的含量最多（占到 80%-90%），那我們就想辦法去除掉建庫(kù)中最大的干擾因素rRNA，這種富集mRNA的方法就是 rRNA minus 建庫(kù)方法。

接下來(lái)我們分別對(duì)這兩種建庫(kù)方法做詳細(xì)介紹：

polyA positive 建庫(kù)方法

成熟的mRNA都有polyA尾巴，我們先用Oligo dT（帶有一段T序列的磁珠）標(biāo)簽去識(shí)別polyA尾巴從而將mRNA富集出來(lái)，然后用 random 的 primer 對(duì)它進(jìn)行擴(kuò)增，此時(shí)我們就拿到了第一條鏈 是一條RNA、DNA雜合體，我們?cè)儆?random 的 primer 對(duì)第二條鏈進(jìn)行擴(kuò)增這時(shí)我們得到一個(gè)DNA和DNA的結(jié)構(gòu)，這時(shí)我們?cè)儆媚┒诵迯?fù)酶把它補(bǔ)平為平末端然后在它 3' 末端加一個(gè)A，加完A后相當(dāng)于把平末端變成一個(gè)黏性末端，之后加上adapter，就可以上機(jī)進(jìn)行測(cè)序了。

rRNA minus 建庫(kù)方法

第一步還是提出 total 的 RNA，我們有18S、28S、5.8S等這些不同種類的 rRNA 的標(biāo)簽，它特異性的結(jié)合 rRNA 的序列，這些標(biāo)簽上都有抗體方便我們特異性的識(shí)別并把它們?nèi)〕觯藭r(shí)我們就去除了細(xì)胞中含量最多的RNA種類 — rRNA，一般為了保險(xiǎn)起見，需要進(jìn)行兩次rRNA minus的去除，然后對(duì)剩下的RNA進(jìn)行打斷和建庫(kù)。

兩種建庫(kù)方法的比較

第一種方法 — polyA positive 只拿成熟的mRNA進(jìn)行建庫(kù)，第二種方法 — rRNA minus 除了有不成熟的 mRNA 還有一些 tRNA、microRNA 等等

如果你只想研究成熟的mRNA那肯定選第一種建庫(kù)策略，如果想研究一些其他種類的RNA或者RNA降解的一些問(wèn)題，那必須選擇第二種建庫(kù)策略。

從兩種建庫(kù)策略我們可以看出，第二種建庫(kù)策略涵蓋的信息多，那為什么我們不都選擇第二種呢？因?yàn)椋旱谝唬诙N策略需要更多的測(cè)序量；第二，第二種建庫(kù)策略更貴，貴大概兩倍左右。

比較兩種建庫(kù)策略測(cè)出的基因表達(dá)量

這篇paper對(duì)比了兩種建庫(kù)方法的基因表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)了 rRNA minus 建庫(kù)方法其原始數(shù)據(jù)更高一些，這也好理解，因?yàn)閞RNA minus 建庫(kù)時(shí)除了成熟的mRNA之外還有不成熟的mRNA（mRNA前體）和少量其他種類的RNA，所以最后測(cè)出的基因表達(dá)量整體比例會(huì)相對(duì)高一些。

兩種建庫(kù)策略比對(duì)到基因組后的差異

比對(duì)到參考基因組上，這兩種比對(duì)策略會(huì)有什么不同呢？看這篇文章里面的圖：

第一列和第三列是來(lái)自不同數(shù)據(jù)集，但用同一種建庫(kù)策略(polyA positive)的結(jié)果，差別不大；第二列和第四列使用的是 rRNA minus 建庫(kù)策略。
淺藍(lán)色：Coding+UTR 表示能翻譯成蛋白的 region
淺黃色：Intronic 內(nèi)含子區(qū)
淺粉色：Intergenic 基因間 region
淺紫色：Unaligned 不確定的 region

第一種建庫(kù)策略 (polyA positive) 即第一列和第三列中大部分的reads（ 62.3%/75.7%）落在了Coding region，即能翻譯成蛋白的區(qū)域；
第二種建庫(kù)策略 (rRNA minus)即第二列和第四列中占比較多的是 Intergenic region以及 Intronic region，而在第一種建庫(kù)策略中落在這兩個(gè)區(qū)域的reads占比都很少，這是為什么呢？因?yàn)閞RNA minus建庫(kù)方法可以獲得比較多的沒有被剪切掉的Introne(內(nèi)含子)的信息，用它來(lái)非常好的衡量 alternative splicing (可變剪切)。

整個(gè)基因組中能翻譯成蛋白或有特定功能的序列我們叫做基因，基因在整個(gè)基因組中占比不超過(guò)5%，但是有一點(diǎn)我們必須清楚的知道，基因組絕大部分是可以被轉(zhuǎn)錄的只是除了那5%以外大部分序列并不行使功能，這就是為什么在使用rRNA minus建庫(kù)的時(shí)候會(huì)有大部分的reads回帖到了 Intergenic region 即基因間區(qū)。

鏈特異性的轉(zhuǎn)錄組分析

在講鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析之前回憶一下，之前是怎么建的庫(kù)，以 polyA positive 為例。首先把帶有polyA尾巴的mRNA富集出來(lái)，然后直接打斷，再用random primer將mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到RNA、DNA雜合體，我們?cè)儆?random 的 primer 對(duì)第二條鏈進(jìn)行擴(kuò)增這時(shí)我們得到DNA和DNA的結(jié)構(gòu)，當(dāng)形成雙鏈DNA的時(shí)候就丟失要傳遞的信息是來(lái)自于正鏈還是來(lái)自于反鏈？也就是在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候沒有方向性使用的都是random primer，這就是我們平時(shí)所使用的鏈非特異性的測(cè)序，我們平時(shí)所測(cè)序的99%都是鏈非特異性的。

鏈非特異性測(cè)序會(huì)存在哪些問(wèn)題呢？

我們?cè)诨蚪M分析的時(shí)候，特別是人類基因組，有一些基因是有overlap的，而且絕大多數(shù)的基因在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)偏差：比如有一段基因在正鏈在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候不一定就老老實(shí)實(shí)的按照正鏈去轉(zhuǎn)錄，也會(huì)往反鏈轉(zhuǎn)錄一定的距離，這就會(huì)形成一些干擾。

解決這些干擾我們要使用鏈特異性的建庫(kù)方法，鏈特異性建庫(kù)方法最常用的是如圖這三種，這三種中最常用的是中間那一種：

分鏈建庫(kù)策略

中間這種建庫(kù)方法是基于dUTP的方法，首先不管用哪種方法進(jìn)行富集，我們先得到了目標(biāo)RNA（通常是mRNA），拿到RNA之后我們先用 random primer 進(jìn)行反轉(zhuǎn)，我們?cè)诤铣傻诙l鏈的時(shí)候插入了U，我們知道DNA上是沒有U的，這里我們?nèi)藶榈慕o它插入U(xiǎn)，所以說(shuō)我們合成的第二條鏈肯定帶有U。它肯定來(lái)自于random primer 的轉(zhuǎn)錄而不是來(lái)自于最原始的那一條鏈，然后用專門能去掉U的酶，這種酶可以把含U的那條鏈全部切碎，這樣的話就只剩下第一條鏈了，也就是反轉(zhuǎn)錄時(shí)的第一條最原始的鏈，我們用這些鏈進(jìn)行建庫(kù)。這時(shí)候左邊的 adapter 和右邊的 adapter 是有方向性的了，我們把這個(gè)信息保留下來(lái)，這樣的話在進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序的時(shí)候我們就可以知道它到底是來(lái)自于基因組的正鏈還是來(lái)自于基因組的負(fù)鏈。我們就通過(guò)這種方法解決了鏈的特異性的問(wèn)題。當(dāng)一個(gè)基因組正鏈也有基因反鏈也有基因的時(shí)候，某條序列只帖到反鏈沒帖到正鏈，我們就可以說(shuō)正鏈基因沒有轉(zhuǎn)錄或者是轉(zhuǎn)錄水平非常低以至于檢測(cè)不到。

我們舉個(gè)例子：

分鏈建庫(kù)策略的優(yōu)勢(shì)

ICAM4基因有001/002/003這三種transcript（轉(zhuǎn)錄本），它們是分布在正鏈的，它的反鏈還有一個(gè)基因叫做CTD，它在負(fù)鏈，如果不分鏈的情況下比對(duì)到正鏈的reads我們用藍(lán)色表示，比對(duì)到負(fù)鏈的reads我們用綠色表示。不分鏈時(shí)（Nonstranded）就會(huì)發(fā)現(xiàn)結(jié)果既有藍(lán)色又有綠色，這時(shí)我們不能說(shuō)CTD基因不表達(dá)。

同樣的樣本我們用分鏈建庫(kù)方法（Stranded）進(jìn)行測(cè)序時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)，所有的序列全部回帖到了負(fù)鏈上，證明ICAM基因不表達(dá)。

單端測(cè)序(SE) VS 雙端測(cè)序(PE)

測(cè)序的時(shí)候是選擇單端測(cè)序還是雙端測(cè)序？

答：能選擇雙端測(cè)序的時(shí)候一定選雙端測(cè)序。

SE or PE

大概是28-29bp，所有說(shuō)那些短于28/29bp的序列，比對(duì)到參考基因組時(shí)會(huì)有好幾個(gè)結(jié)果，也就是說(shuō)這些短序列在基因組上找位置的時(shí)候能找到好多個(gè)。mapping到這么多位置上以至于我們不知道到底應(yīng)該是哪個(gè)，這時(shí)候就應(yīng)該延長(zhǎng)測(cè)序長(zhǎng)度。

illumina二代測(cè)序已經(jīng)可以測(cè)到150bp，但是150bp map到一端還是不夠的，所以我們?cè)诮◣?kù)的時(shí)候打斷成的片段盡量長(zhǎng)一些，打斷到500bp進(jìn)行雙端測(cè)序，上游也就是5' 端可以測(cè)到150bp，下游也就是reads2也可以測(cè)150bp，這樣的話中間還空了200bp（500-150*2=200），在回帖到參考基因組上時(shí)，我們的reads1回帖到一個(gè)位置，reads2也回帖到一個(gè)位置，當(dāng)這兩個(gè)位置離的特別近大概在100/200bp的時(shí)候，我們就可以確定這是一個(gè)合理的回帖。這樣我們就用了500bp的信息確定了這對(duì)reads 回帖到參考基因組的具體位置，也就是說(shuō)用500bp的信息基本上實(shí)現(xiàn)了unique map。

所以說(shuō)建議用雙端測(cè)序（PE），這樣可以使序列能夠更好更準(zhǔn)確的回帖到參考基因組上，基本上能夠保證80%都是unique map。

但在測(cè)小RNA時(shí)是例外，比如microRNA，成熟的microRNA只有21-22bp，雙端測(cè)150bp純屬浪費(fèi)，單端測(cè)50bp就可以實(shí)現(xiàn)unique map。再比如最長(zhǎng)的snoRNA也就300-400bp左右；成熟的tRNA 只有70bp； 成熟的snRNA也就70-80bp，所以說(shuō)測(cè)這些小RNA（miRNA）的時(shí)候都不用雙端150bp。

總結(jié)一下，針對(duì)mRNA建庫(kù)無(wú)論是 polyA positive 還是 rRNA minus 也不管分不分鏈，一定要使用雙端測(cè)序，小RNA建庫(kù)的話要根據(jù)分析的內(nèi)容確定是雙端測(cè)序還是單端測(cè)序。

衡量提取RNA和建庫(kù)的質(zhì)量

人體中絕大部分的RNA都是rRNA（核糖體RNA）占90%左右，人體的核糖體RNA主要分成兩類，第一類，主要來(lái)源于細(xì)胞核，是根據(jù)細(xì)胞核里面染色體的序列轉(zhuǎn)錄并加工的；第二類，來(lái)自于線粒體中的兩個(gè)rRNA基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的。針對(duì)第一類的rRNA主要分成：5.8S、5S、28S和18S。5.8S、28S和18S它們的量基本上是一致的，5S的量跟它們不太一樣，因?yàn)?S會(huì)在整個(gè)基因組上散落分布。另外一種來(lái)自于線粒體上的有5S、23S和16S，整個(gè)rRNA最主要的、占比最多的是來(lái)源于細(xì)胞核的那四種（5.8S、5S、28S和18S）。

rRNA的種類

total RNA 提取的電泳圖

total RNA提取的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) RIN（RNA Integrity Number）

下面我們學(xué)習(xí)一下如何看這張電泳儀輸出的total RNA提取的質(zhì)量圖。

學(xué)會(huì)看RIN（RNA Integrity Number）圖

我們可以從上圖中看到5S region 、18S region 、28S region 的peak，這些峰如果像marker的峰一樣shark的話就比較好。

轉(zhuǎn)錄組的比對(duì)與定量策略

主要講解拿到序列后怎樣比對(duì)、怎樣選擇合適的參考基因組、用哪種參數(shù)定表達(dá)量？

怎樣將提取來(lái)的RNA序列回帖到參考基因組，也就是怎樣確定該RNA來(lái)源于哪個(gè)基因，也就是怎樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的mapping。
只討論mRNA的情況下，一般來(lái)說(shuō)有兩種思路：

• 把測(cè)序的結(jié)果mapping到成熟的mRNA參考序列上；
  優(yōu)點(diǎn)：不用處理可變剪切的問(wèn)題；
  缺點(diǎn)：不能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本
• 把測(cè)序結(jié)果mapping到參考基因組序列上；
  優(yōu)點(diǎn)：可以發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，可以進(jìn)行isoform層次的定量；
  缺點(diǎn)：不能使用之前DNA mapping軟件

一個(gè)基因有不同的isoform，不同的isoform的量是可以定下來(lái)的。
DNA mapping軟件在mapping的時(shí)候沒有 junction 的問(wèn)題，只有indel、insertion、deletion，所以選擇第二種比對(duì)策略需要新的mapping軟件。

二代測(cè)序最實(shí)用的mapping算法是BWT算法，基于BWT算法的mapping軟件：BWA、BWA-MEM、Bowtie、Bowtie2 ... ...
但是上述軟件最大的問(wèn)題是：針對(duì)DNA比對(duì)設(shè)計(jì)；完全沒有考慮可變剪切的問(wèn)題。
不能直接用于RNA的mapping

什么是可變剪切？

RNA需要面臨的可變剪切問(wèn)題

中心法則是從DNA到RNA，RNA到蛋白質(zhì)，真實(shí)情況是在真核細(xì)胞里面，DNA轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)并不能全部轉(zhuǎn)錄成有用的mRNA，就會(huì)分成Exon（外顯子）和 intron（內(nèi)含子），成熟的mRNA都是由Exon（外顯子）組成的，如圖Exon1/2/3/4/5可以拼出一個(gè)成熟的mRNA；Exon1/2/4/5也可以拼出一個(gè)成熟的mRNA；Exon1/2/3/5也可以拼出一個(gè)成熟的mRNA，這三個(gè)成熟的mRNA分別可以翻譯成對(duì)應(yīng)的proteinA、proteinB、proteinC，但它們都是來(lái)自于同一個(gè)基因，對(duì)于這種來(lái)自同一個(gè)區(qū)域經(jīng)過(guò)不同的剪切形成不同的mRNA最后翻譯成不同的蛋白質(zhì)這種就叫做不同的isoform，這種來(lái)自于同一個(gè)基因形成的三種不同的mRNA，我們叫做三種不同的轉(zhuǎn)錄本但是它們都是來(lái)自同一種基因。

常見的5種可變剪切形式

在RNA比對(duì)的時(shí)候如果需要考慮可變剪切的問(wèn)題，也就是說(shuō)一條reads有可能來(lái)自于緊挨著的 Exon1、Exon2， 但是在回帖到基因組的時(shí)候 Exon1 和 Exon2 可能離的特別遠(yuǎn)中間會(huì)跨一個(gè)很大的junction，這種情況下怎么辦呢？這個(gè)時(shí)候就需要這3種比對(duì)策略：

RNA的3種比對(duì)策略

第一種比對(duì)策略是：Exon-first approach
基因組上哪些地方是Exon（外顯子）哪些地方是 intron（內(nèi)含子）我們是知道的。
把RNA序列完整的回帖到參考基因組上，能回帖上的就先回帖上，回帖不上的就按照一定的規(guī)則拆開，拆開后再分別去回帖，比如我們拆成兩個(gè)部分一個(gè)回帖到了A位置，一個(gè)回帖到了B位置，A、B只要離的不太遠(yuǎn)且中間正好是一個(gè)intron（內(nèi)含子）我們就認(rèn)為這是一個(gè)合理的mapping。這種RNA比對(duì)方法就叫做Exon-first approach。

第二種比對(duì)策略是：Seed-extend approach
先把序列切的特別碎，這樣每一段序列都相當(dāng)于一個(gè)小種子（Seed），這種小種子在回帖在基因組時(shí)會(huì)map到非常非常多的位置，把小種子能map到的所有位置都找出來(lái)，對(duì)比Exon的樣子把這些小序列能連在一起的連在一起，連不到一起的就認(rèn)為是intron（內(nèi)含子），這種RNA比對(duì)方法就叫做Seed-extend approach。

第三種比對(duì)策略是：Potential Limitation of exon-first approach
有點(diǎn)像第一種比對(duì)策略的改進(jìn)版，在比對(duì)的時(shí)候一條序列如果它既能直接比對(duì)到基因組上，又能拆開之后比對(duì)到基因組上，比如，有一條reads正好能完全匹配到基因組的A位置，但是把如果把這條序列中間拆開一下，在中間有一個(gè)intron（內(nèi)含子）的情況下卻比對(duì)到了B位置，這種比對(duì)方法可以根據(jù)具體的需求選擇是同時(shí)保留這兩種情況，還是保留第一種或者保留第二種。

目前RNA-Seq的比對(duì)軟件都是這三種比對(duì)策略當(dāng)中的一種。

Tophat使用了第一種比對(duì)策略：

• 比對(duì)過(guò)程調(diào)用了Bowtie；
• 先比對(duì)能比對(duì)上的reads；
• 比對(duì)不上的reads根據(jù)可變剪切的方式拆開再比對(duì)；

• 最大的問(wèn)題是，處理不好假基因（pseudogene）的問(wèn)題

  
  
  Tophat使用了第一種比對(duì)策略

假基因（pseudogene）怎么來(lái)的呢？
正常情況下是DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA的Exon（外顯子）再連到一起，intron（內(nèi)含子）去掉，但是細(xì)胞里存在這樣一個(gè)通路，可以把mRNA再插入到基因組上的一個(gè)位置，形成一個(gè)假基因（pseudogene），假基因（pseudogene）一般來(lái)說(shuō)是不表達(dá)的，當(dāng)A基因有一個(gè)假基因的時(shí)候我們叫 A' ，它的序列相當(dāng)于A基因把所有Exon（外顯子）都拼到一起了，這時(shí)候我有一條序列正好跨Exon（外顯子）的junction，那么比對(duì)軟件就會(huì)選在 A' 位置可以不用打開一個(gè)junction，直接就能比對(duì)到這兒，在基因A這個(gè)位置必須開一個(gè)intron（內(nèi)含子）的junction才能比對(duì)到這兒，這個(gè)時(shí)候比對(duì)軟件就可以很自然的把這條序列比對(duì)到A' 這個(gè)位置而不是A這個(gè)位置，這就是假基因所帶來(lái)的問(wèn)題。

Tophat2 主要改進(jìn)的2個(gè)問(wèn)題：

Tophat2 主要改進(jìn)的2個(gè)問(wèn)題

Tophat2比對(duì)介紹

整體來(lái)說(shuō)，Tophat2比對(duì)的效果還是不錯(cuò)的，但是有一個(gè)最大得到問(wèn)題就是占用資源太多，而且比對(duì)的速度太慢，因?yàn)樗诒葘?duì)的時(shí)候存在一個(gè)調(diào)用的過(guò)程 —— Tophat調(diào)用的是bowtie；Tophat2調(diào)用的是bowtie2

所以說(shuō)，同一伙兒人又搞了一個(gè)HISAT軟件，它主要是一個(gè)Tophat2升級(jí)的版本提高了index的構(gòu)建方式，從而達(dá)到占用資源小，比對(duì)速度快的目的。在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)推薦使用HISAT軟件進(jìn)行比對(duì)

還有一個(gè)常用的比對(duì)軟件是STAR，它的優(yōu)勢(shì)是快，缺點(diǎn)是占用內(nèi)存比較大，我們知道人類基因組一共才有3G，但STAR在mapping的時(shí)候需要28-32G的內(nèi)存。

STAR軟件的比對(duì)策略

使用的是上面介紹的第二種比對(duì)策略

• STAR的優(yōu)勢(shì)在于快，能夠快速mapping；

• 缺點(diǎn)在于占用內(nèi)存巨大，human的mapping需要28-32G的內(nèi)存

  
  
  STAR軟件的比對(duì)策略
  
  

  為了能夠快速mapping，STAR軟件把全部的seed提前做好了，index會(huì)提前讀進(jìn)去，所以說(shuō)內(nèi)存占用非常大。

許多比對(duì)軟件，比如：Tophat、Tophat2、HISAT 它們的核心算法都是BWT算法

BWT的算法推導(dǎo)與核心原理：孟浩巍知乎文章鏈接

RPKM VS FPKM

先理解一下所謂的 raw count 是什么？就是樣本中比對(duì)到某個(gè)基因的 reads count
比如某個(gè)測(cè)序的序列比對(duì)到基因的Exon（外顯子）上，
樣本一中 a基因比對(duì)上了1000條reads，b基因比對(duì)上了2000條reads
樣本二中 a基因比對(duì)到了2000條reads，b基因比對(duì)到了4000條reads
這時(shí)，是否就可以認(rèn)為：
1、樣本內(nèi)比較，b基因的表達(dá)量就比 a 基因高
2、樣本間比較，a/b兩個(gè)基因的表達(dá)量樣本二比樣本一高出兩倍
答案肯定是不行的

我們看下面這張圖，有四個(gè)基因分別是1/2/3/4：

RPKM / FPKM 是一對(duì)兒概念

所以說(shuō)針對(duì)illumina二代測(cè)序 pair-end（雙末端） 的數(shù)據(jù)，F(xiàn)PKM是該基因RPKM數(shù)值的二分之一，換句話說(shuō)就是，RPKM = FPKM * 2

RPKM / FPKM就相當(dāng)于對(duì)測(cè)序量和基因Exon（外顯子）的長(zhǎng)度進(jìn)行了矯正。

TPM

TPM中T指的是transcript（轉(zhuǎn)錄本），翻譯成人話就是每測(cè)1兆reads，每一條轉(zhuǎn)錄本上有多上條reads map上，相當(dāng)于FPKM的小修小改。

在計(jì)算FPKM的時(shí)，比如有兩個(gè)樣本測(cè)序量不一樣那不同基因的表達(dá)量有可以一樣也有可能不一樣，但FPKM的總體加和往往是不一樣的，這就會(huì)讓我們覺著在比對(duì)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，TPM就是為了應(yīng)對(duì)這樣的問(wèn)題而出現(xiàn)的，比如說(shuō)我們算基因 i 的TPM，根據(jù)公式我們首先必須算它的FPKM，它的FPKM占整個(gè)基因組的FPKM的百分之多少再乘以 10^6 就是TPM了，所以說(shuō)TPM的本質(zhì)是一個(gè)百分?jǐn)?shù)，一個(gè)RNA-Seq的TPM一定是10^6 ，TPM的優(yōu)勢(shì)在于它可以很好的衡量樣本之間表達(dá)量差異的情況，因?yàn)樗颜麄€(gè)樣本進(jìn)行normaliza 了，保證了各樣本TPM的加和是一致的是10^6，也就是這樣的原因TPM得到了越來(lái)越多的推崇。

RSEM

RSEM主要是用了機(jī)器學(xué)習(xí)的辦法來(lái)估基因的 reads count 有多少，RSEM數(shù)值上相當(dāng)于對(duì)測(cè)序量和基因Exon（外顯子）的長(zhǎng)度進(jìn)行了矯正，與傳統(tǒng)的FPKM不太一樣的是，傳統(tǒng)的FPKM也是進(jìn)行了矯正，但FPKM是直接除以了Exon的長(zhǎng)度，而RSEM認(rèn)為這樣并不能完全解決問(wèn)題，應(yīng)該把它看成一個(gè)概率模型估出來(lái)一個(gè)修正的值，這個(gè)處理流程是一個(gè)很復(fù)雜的流程：

總體來(lái)說(shuō)，RPKM沒什么人用了，因?yàn)楝F(xiàn)在基本上都是 pair-end 測(cè)序，F(xiàn)PKM現(xiàn)在是主流，但是FPKM不如TPM方便，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)里面給了很多的表達(dá)量都是RSEM。
RSEM整個(gè)的評(píng)估號(hào)稱要比FPKM要穩(wěn)定和準(zhǔn)確，但是RSEM在理解上不是很直觀。
TPM是一個(gè)比較好的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗殖C正了長(zhǎng)度又矯正了測(cè)序量而且還能保證每個(gè)sample總數(shù)是固定的。

上機(jī)操作部分

• RNA-Seq的本質(zhì)是什么？
• RNA-Seq尋找差異基因是為了干什么？
• Raw Count 是什么東西？怎么算？
• FPKM/TPM 是什么東西？怎么算？
• Cuffdiff的原理
• DESeq2的原理

轉(zhuǎn)錄組在整個(gè)NGS 中是一個(gè)核心的位置，它啟到承上啟下的作用，承上它是對(duì)DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，啟下就是必須有蛋白才能行使功能，沒有RNA是不可能有蛋白質(zhì)的

RNA-Seq的本質(zhì)是對(duì)RNA進(jìn)行定量！！！

思考：對(duì)RNA進(jìn)行定量了怎么就有意義了？RNA定量定的是絕對(duì)量還是相對(duì)量呢？

答：RNA-Seq定量定的是相對(duì)的量

為什么要去找差異基因？

• DNA ---> RNA ---> 蛋白質(zhì) ---> 功能
• 要實(shí)現(xiàn)一個(gè)具體的功能，蛋白的含量大概率需要變化，而蛋白含量的變化要形成一個(gè)穩(wěn)態(tài)，RNA水平大概率會(huì)變
• 綜上，尋找差異基因的本質(zhì)是通過(guò)RNA變化來(lái)推測(cè)蛋白的變化

Raw Count 是什么東西？

我們已經(jīng)知道了RNA-Seq是為了找差異表達(dá)基因也就是 DEG differencial expression genes
找差異那一定得有至少兩個(gè)來(lái)比較，也就是說(shuō)在尋找差異表達(dá)基因的時(shí)候一定得有一個(gè) input1 和 input2
GeneA：input1 - reads count --> 數(shù)一下在input1中有多少reads map到GeneA；
GeneA：input2 - reads count --> 數(shù)一下在input2中有多少reads map到GeneA

fold change = input2 - reads count / input1 - reads count
我們把得到的這兩個(gè)數(shù)一除，就得到 fold change（倍數(shù)變化）

FC = 1.5 ？ p-value ？
FC = 1.1 ？ p-value ？

然后進(jìn)行一個(gè)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，告訴我們 fold change 等于1.5時(shí)，差異是否顯著，p-value是多少；fold change 等于1.1時(shí)，差異是否顯著，p-value是多少。

也就是說(shuō)，對(duì)于GeneA我們想知道它的表達(dá)量是升高了還是降低了，我們只要數(shù)在對(duì)照組里面（input1）有多少條reads回帖到了GeneA，然后在實(shí)驗(yàn)組里面（input2）數(shù)有多少條reads回帖到了GeneA，然后算一個(gè)fold change （ input2 - reads count / input1 - reads count），等到的FC再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

在這個(gè)過(guò)程中，值得注意的兩個(gè)問(wèn)題是：

• 一、測(cè)序量是否一致
• 二、2000 --> 2500 VS 200 --> 250 這兩個(gè)變化到底哪個(gè)更顯著？

這兩個(gè)問(wèn)題在RNA-Seq中屬于比較棘手的問(wèn)題。

問(wèn)題1，測(cè)序量的問(wèn)題其實(shí)是很好解決的，直接矯正測(cè)序量就可以了，也就是我們常說(shuō)的 normalization 常用的有這三種矯正方法：

1. quantile
2. genometry
3. traditional

問(wèn)題2，怎樣去衡量，哪個(gè)才是真正顯著的？
基本假設(shè)！！！！：

1. 大部分的基因表達(dá)量不變；
2. 高表達(dá)的基因表達(dá)量不變

Why？回答這個(gè)問(wèn)題我們一定要明白 p-value 是怎么算出來(lái)的？
我們首先得有一個(gè)0假設(shè)-->兩者沒有差異，再來(lái)一個(gè)1假設(shè)-->兩者有差異，然后算出一個(gè)統(tǒng)計(jì)量x ，給出一個(gè)置信區(qū)間阿爾法α，這種條件下肯定H0或者否定H1
H0：兩者沒有差異
H1：兩者有差異
統(tǒng)計(jì)量x，α = 0.05，肯定H0或者否定H1

input1（對(duì)照組）和input2（實(shí)驗(yàn)組）在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的時(shí)候，認(rèn)為GeneA在兩組條件下表達(dá)沒有差異，兩個(gè)分布應(yīng)該是同一個(gè)整體分布，在同一個(gè)整體分布的時(shí)候觀察到在input1總體中（對(duì)照組）reads count 為2000的情況下p-value為多少？同時(shí)觀察在input2總體中（實(shí)驗(yàn)組）reads count 為2500的情況下p-value為多少？
假如 p-value = 0.001 即單次試驗(yàn) p-value<0.05 ，說(shuō)明這是一個(gè)小概率事件，小概率事件在單次實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為不發(fā)生，但它發(fā)生了，所以我們認(rèn)為我們的0假設(shè)不對(duì)，所以兩者有差異。

知道了這個(gè)，我們?cè)倩赝苹厝ィ瑸槭裁创蟛糠值幕虮磉_(dá)量不變？就是因?yàn)槲覀兊?假設(shè)，大部分的基因表達(dá)量不能變?nèi)绻兊脑挘覀兯械慕y(tǒng)計(jì)沒有辦法操作。

在捋一下p-value的事兒：
H0是認(rèn)為兩者沒有差異；H1是認(rèn)為兩者有差異，構(gòu)造一個(gè)統(tǒng)計(jì)量在input1中觀察到reads count是2000，在input2中觀察到reads count 是2500，那么觀測(cè)2000和2500的概率是p-value=0.001
由于p-value<0.05，那么這就是一個(gè)小概率事件，小概率事件單次實(shí)驗(yàn)不發(fā)生，但這里卻發(fā)生了，因此否定H0，所以有差異。

解決第二個(gè)問(wèn)題：為什么高表達(dá)的基因不能變？

假如說(shuō)基因組就有 gene A ，B，C
總共測(cè)了200條reads，gene A有150條；geneB 和geneC 各25條 這是input1；在input2中同樣只有g(shù)ene A ，B，C，同樣測(cè)了200條reads，當(dāng)高表達(dá)量基因 geneA降低到100條，gene B C 沒有變化時(shí)，
客觀條件下應(yīng)該是這種情況：
input1：200 = 150 + 25 + 25
input2：150 = 100 + 25 + 25

但，實(shí)際測(cè)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)這種情況：
input1：200 = 150 + 25 + 25
input2：200 = 130 + 35 + 35

實(shí)際上高表達(dá)基因 gene A 從150 變成了100 發(fā)生了顯著變化，gene B C 沒有發(fā)生顯著變化；但是實(shí)際測(cè)的情況確實(shí)基因 A 從150 變成了 130 并沒有發(fā)生顯著變化，而gene B C 從25 變到 35 發(fā)生了顯著變化

所以說(shuō)，當(dāng)一個(gè)高表達(dá)基因發(fā)生顯著變化的時(shí)候，它會(huì)把其他基因拉跑偏，所以說(shuō)我們?cè)谶M(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的時(shí)候一定要遵循基本假設(shè)：大部分的基因表達(dá)量不變；高表達(dá)的基因表達(dá)量不變。

那么，問(wèn)題來(lái)了，如果高表達(dá)的基因表達(dá)量變了怎么辦？如果大部分的基因表達(dá)量發(fā)生了變化怎么辦？

解決方案：

• 第一，摻入 spike-in （適用于解決1/2假設(shè)不成立時(shí)）
  人工摻入一個(gè)我們已知量的東西，變成絕對(duì)定量
• 第二，使用 house keeping gene 進(jìn)行校正 （適用于解決2假設(shè)不成立時(shí)）
  house keeping gene是維持細(xì)胞基本代謝所需要的基因，而且細(xì)胞和細(xì)胞之間house keeping gene的表達(dá)量不太變。

FPKM的本質(zhì)是什么？
FPKM本質(zhì)是對(duì)測(cè)序深度，基因長(zhǎng)度做了矯正
FPKM =（reads count / exon length / total reads）* 10^9
最后乘以10^9 是為了單位好看一些

TPM類似
TPM = （FPKM / total FPKM）* 10^6

FPKM VS TPM

FPKM or Raw count？

cuffdiff pipeline：

FASTQ-reads --> mapping （HISAT2，tophat2）--> BAM --> cuffdiff --> DEGs（FPKM）

cuffdiff 那一套

DESeq2 pipeline：

FASTQ-reads --> mapping （HISAT2，tophat2）--> BAM --> Gene Raw Count --> find DEGs in R （No FPKM）

DESeq2 那一套

泊松分布與負(fù)二項(xiàng)分布

什么是負(fù)二項(xiàng)分布？
有兩盒火柴分別有A根火柴和B根火柴，把A盒火柴放到左口袋里，把B盒火柴放到右口袋里，每次用火柴的時(shí)候隨機(jī)從左口袋或者右口袋取一根，直到有第一盒火柴用完的時(shí)候，那用火柴的次數(shù) x，一定滿足：sum(A, B) >= x >= min(A, B)

再次舉例說(shuō)明：
一袋小球里面有黑球和白球，黑球有a個(gè)，白球有b個(gè)，每次從袋子里隨機(jī)抽一個(gè)小球，需要抽多少次才能把其中一種顏色的球抽完？這個(gè)問(wèn)題就和我們基因組的問(wèn)題很接近了，我們基因組可以分成兩個(gè)部分：基因 和 非基因。對(duì)于任意一個(gè)基因 gene1，基因上就是：gene1，non-gene1，測(cè)序比對(duì)后就會(huì)發(fā)現(xiàn)有一些reads會(huì)map到gene1的位置，那么能map到gene1位置的事件就近似服從負(fù)二項(xiàng)分布。因?yàn)榫拖喈?dāng)于從整體里面進(jìn)行抽樣，我認(rèn)為能map到gene1就是從整體里面去抽樣正好把gene1抽出來(lái)了，抽完之后reads再回帖回來(lái)。

負(fù)二項(xiàng)分布和泊松分布其實(shí)差不太多，在次數(shù)比較大的時(shí)候這兩個(gè)沒啥區(qū)別，次數(shù)比較小的時(shí)候負(fù)二項(xiàng)分布的離散性更低一些。基本上我們現(xiàn)在做的基因組的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是用負(fù)二項(xiàng)分布。

學(xué)習(xí)DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析

使用DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析首先需要計(jì)算 Raw reads Count

計(jì)算gene的Raw reads Count的方法

• 方法1. 使用知乎Live主—孟浩巍的代碼，或者根據(jù)代碼修改自己的需求；
  優(yōu)點(diǎn)：在R中完成操作，支持多線程；
  缺點(diǎn)：內(nèi)存占用比較大；

• 方法2. 使用htseq-count程序
  優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省內(nèi)存
  缺點(diǎn)：不夠優(yōu)雅，需要對(duì)讀取進(jìn)來(lái)的內(nèi)容再做處理

方法1,2本質(zhì)沒有差別，我們以方法1為例子進(jìn)行演示

將孟浩巍寫的計(jì)算 Raw reads Count 的R代碼文件Count_RNASeq.R放到服務(wù)器上（R代碼解釋后面講）

我們?cè)诜?wù)器的命令行輸入 Rscript Count_RNASeq.R 就會(huì)告訴我們命令格式：

$ Rscript Count_RNASeq.R
Loading required package: magrittr
Count_RNASeq.R Usage like:
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Rscript Count_RNASeq.R --input XXX --label XXX --type XXX --threads XXX --output XXX
----------------------------------------------------------------------------------------------------
    --input : input bam file list, format like bam1,bam2,bam3...
    --label : the same length as --input, format likt label1,label2,label3...
    --type : the sample type ,the same length as --input, format likt ctrl,ctrl,ko,ko...
    --threads : the CPU limit 
    --output : name of RData that contain SummarizedExperiment.obj
Error: Input parameters error!
Execution halted

單看不太容易看明白其實(shí)舉個(gè)例子就很簡(jiǎn)單，比如，我們有兩個(gè)分組 WT、KO，那么--input --label --type --threads --output 這些命令后面的文件格式按照上面給的要求寫好就是這個(gè)樣子：

--input ./wt.rep1.bam,./wt.rep2.bam,./wt.rep3.bam,./ko.rep1.bam,./ko.rep2.bam,./ko.rep3.bam,

--label  WT.rep1,WT.rep2,WT.rep3,KO.rep1,KO.rep2,KO.rep3

--type WT,WT,WT,KO,KO,KO

--threads 6

--output ./RNA_raw_count.RData

注意，--input 和--label后面的文件是一一對(duì)應(yīng)的； --threads是指定用多少個(gè)核，我們這里有6個(gè)文件，所以指定的是6個(gè)核，多了也沒用少了浪費(fèi)時(shí)間； --output 最后會(huì)保存成R語(yǔ)言能夠讀成的格式，自己起個(gè)名字后綴加上.RData就行。

各個(gè)參數(shù)寫好之后還要調(diào)整一下（中間可以有空格但不能換行）：

Rscript Count_RNASeq.R --input ./wt.rep1.bam,./wt.rep2.bam,./wt.rep3.bam,./ko.rep1.bam,./ko.rep2.bam,./ko.rep3.bam, --label  WT.rep1,WT.rep2,WT.rep3,KO.rep1,KO.rep2,KO.rep3 --type WT,WT,WT,KO,KO,KO --threads 6 --output ./RNA_raw_count.RData

這樣我們就可以在服務(wù)器上運(yùn)行計(jì)算gene的Raw reads Count的程序了，為什么不直接在RStudio上直接運(yùn)行，還要這么費(fèi)勁的將R代碼整到服務(wù)器上，因?yàn)閭€(gè)人電腦帶不起來(lái)呀！！！

我們把Count_RNASeq.R 文件（計(jì)算gene的Raw reads Count的代碼文件）里的R代碼理解一下

打印剛剛的說(shuō)明文檔代碼：

# help function 
my_help <- function(){
  cat("Count_RNASeq.R Usage like:\n")
  cat("----------------------------------------------------------------------------------------------------\n")
  cat("Rscript Count_RNASeq.R --input XXX --label XXX --type XXX --threads XXX --output XXX\n")
  cat("----------------------------------------------------------------------------------------------------\n")
  cat("\t--input : input bam file list, format like bam1,bam2,bam3...\n")
  cat("\t--label : the same length as --input, format likt label1,label2,label3...\n")
  cat("\t--type : the sample type ,the same length as --input, format likt ctrl,ctrl,ko,ko...\n")
  cat("\t--threads : the CPU limit \n")
  cat("\t--output : name of RData that contain SummarizedExperiment.obj\n")
}

讀參數(shù)，輸入的參數(shù)是通過(guò)下面這樣的方式讀進(jìn)來(lái)的：

# 1. check args length 
args = commandArgs()
args.length = length(args)

if(args.length != (5 + 5 * 2)){
  my_help()
  stop("Input parameters error!")
}

檢查是否有這些：--input --label --type --threads --output 指定的參數(shù)，如果沒有就停止，然后打印說(shuō)明文檔（my_help()）并報(bào)出錯(cuò)誤提示：Input parameters error!：

# 3.check if all parameter in the list 
parameter_list = c("--input","--label","--type","--threads","--output")
if(! all(parameter_list %in% names(args.list))){
  my_help()
  stop("Input parameters keys error!")
}

如果輸入的都沒有問(wèn)題，就會(huì)把變量都定義好，告訴你INPUT_BAM INPUT_LABEL INPUT_TYPE CPU_THREADS OUTPUT_FILE 都是些啥：

# 4. reads parameters
INPUT_BAM = strsplit(args.list[["--input"]],split=",") %>% unlist()
INPUT_LABEL = strsplit(args.list[["--label"]],split=",") %>% unlist()
INPUT_TYPE = strsplit(args.list[["--type"]],split=",") %>% unlist()
CPU_THREADS = strsplit(args.list[["--threads"]],split=",") %>% unlist() %>% as.integer()
OUTPUT_FILE = strsplit(args.list[["--output"]],split=",") %>% unlist() %>% path.expand()

OUTPUT_DIR = dirname(OUTPUT_FILE)
OUTPUT_BASENAME = basename(OUTPUT_FILE)

然后檢查BAM文件是否存在：

# 5. check if BAM file exist 
if(all(file.exists(INPUT_BAM))){
  print("All file checked exsit!")
}else{
  stop(sprintf("File: '%s' Not Exist!",INPUT_BAM[!file.exists(INPUT_BAM)]))
}

BAM文件是比對(duì)的結(jié)果文件，里面存放了哪些reads比對(duì)到了基因組的哪些位置，我們就是要用BAM文件來(lái)計(jì)算Raw reads Count，所以必須檢查是否存在BAMwe文件。
如果BAM文件不存在會(huì)報(bào)：.......Not Exist!，如果所有的文件都存在所有的設(shè)置沒有問(wèn)題，下面就開始正式的把這些包都載入：

######################################################################################
# required packages 
######################################################################################
require(BiocParallel)
require(GenomicFeatures)
require(GenomicAlignments)
require(Rsamtools)
require(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)

這個(gè)包BiocParallel是R里面并行的一個(gè)包；這個(gè)包GenomicFeatures是做GTF分析必須得用的用來(lái)真正數(shù) reads count 的；這個(gè)包Rsamtools是打開BAM文件用的；這個(gè)包TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene是人的參考基因組轉(zhuǎn)錄組信息。

把input_bam信息讀進(jìn)來(lái)：

input_bamfiles = Rsamtools::BamFileList(INPUT_BAM)

讀進(jìn)來(lái)之后把 bam 文件標(biāo)上 label 就是告訴你每個(gè) bam 是什么：

names(input_bamfiles) = INPUT_LABEL

這兩部整合起來(lái)就是：

######################################################################################
# read BAM file
######################################################################################
input_bamfiles = Rsamtools::BamFileList(INPUT_BAM)
names(input_bamfiles) = INPUT_LABEL

讀入人的GTF文件：

######################################################################################
# load GTF file
######################################################################################
print("Loading GTF file...")
gene_range = GenomicFeatures::exonsBy(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene,by="gene")
print("Done!")

一切準(zhǔn)備就緒我們就開始counting了：

######################################################################################
# counting gene reads
######################################################################################
print("counting...")

# BiocParallel::register(SerialParam())
BiocParallel::register(MulticoreParam(workers=CPU_THREADS))

SummarizedExperiment.obj <- GenomicAlignments::summarizeOverlaps(features=gene_range, 
                                                                 reads=input_bamfiles,
                                                                 mode="Union",
                                                                 singleEnd=FALSE,
                                                                 ignore.strand=TRUE,
                                                                 fragments=TRUE )
print("counting...Done!")

其中 mode 這個(gè)參數(shù)有三個(gè)選項(xiàng)，這里用的是mode="Union"默認(rèn)情況下都是Union模式，另外兩個(gè)分別是：IntersectionStrict 和 IntersectionNotEmpty

此時(shí)，count完成，保存有用的信息成為一個(gè)對(duì)象SummarizedExperiment.obj
并按照指定的輸出位置輸出文件：

######################################################################################
# save data
######################################################################################
# make sample table 
sample_table = DataFrame(case_label = INPUT_LABEL,
                         case_type = INPUT_TYPE,
                         bam_path = INPUT_BAM)

colData(SummarizedExperiment.obj) = sample_table

# save SummarizedExperiment.obj
save(file=OUTPUT_FILE,list="SummarizedExperiment.obj")
print("Save R image... Done!")

rm(list=ls())
print("Clear R env... Done!")

最后清空所有變量，操作完成~

DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析

計(jì)算完gene的raw reads count得到結(jié)果文件SummarizedExperiment.obj后我們就可以用DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析了。

讀入上一步計(jì)算raw reads count的結(jié)果文件 —SummarizedExperiment.obj：

#### 讀取上一步的計(jì)算結(jié)果文件 — SummarizedExperiment.obj
load(file="./ReadsCount.RData")
SummarizedExperiment.obj
colData(SummarizedExperiment.obj)

我們看下上面代碼在R里的運(yùn)行結(jié)果：

> load(file="./ReadsCount.RData")
> SummarizedExperiment.obj
class: RangedSummarizedExperiment 
dim: 23459 4 
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(23459): 1 10 ... 9994 9997
rowData names(0):
colnames: NULL
colData names(2): case_label case_type
> colData(SummarizedExperiment.obj)
DataFrame with 4 rows and 2 columns
   case_label   case_type
  <character> <character>
1     WT.rep1          WT
2     WT.rep2          WT
3     KO.rep1          KO
4     KO.rep2          KO
> 

colData(SummarizedExperiment.obj)運(yùn)行結(jié)果告訴了我們SummarizedExperiment.obj文件里的保存信息。我們可以看到case_type那一列是樣本信息分別是 WT 和 KO。

結(jié)果讀進(jìn)來(lái)后第一步就應(yīng)該構(gòu)建 DESeq 的 DataSet，因?yàn)槲覀冞@里只需要區(qū)分WT 和 KO，所以我們這里面的參數(shù)design只需要按照case_type去區(qū)分就可以了，即：design = ~case_type

#### 構(gòu)建DESeqDataSet
DES_set = DESeqDataSet(SummarizedExperiment.obj,design = ~case_type)

做差異表達(dá)分析就是將上一步構(gòu)建好的DESeq的DataSet — DES_set，扔到函數(shù)DESeq中即可：

#### 進(jìn)行差異表達(dá)分析
DEG_set.run = DESeq(DES_set)

#### 輸出結(jié)果
DEG_set.result = results(DEG_set.run)
DEG_set.result

#### 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)
summary(DEG_set.result)

#### 將結(jié)果保存成data.frame
DEG_set.result.df = as.data.frame(DEG_set.result)

DEG_set.result.df就是最終的結(jié)果文件了，我們打開看一下

DEG_set.result.df

library(org.Hs.eg.db)
columns(org.Hs.eg.db)

gene_symbol = mapIds(x=org.Hs.eg.db,
                     keys = rownames(DEG_set.result.df),
                     keytype = "ENTREZID",
                     column = "SYMBOL")

我們使用的是mapIds這個(gè)函數(shù)來(lái)準(zhǔn)換的，其中各參數(shù)解釋：

• x是基因ID和基因symbol對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，人的就是org.Hs.eg.db；
• keys來(lái)指定想要轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，這里就是基因ID號(hào)即結(jié)果文件DEG_set.result.df的行名（rownames）；
• keytype是想要轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)類型，這里是基因ID號(hào)學(xué)名就是ENTREZID；
• column來(lái)指定我們想把它準(zhǔn)換成的類型，這里是把基因ID準(zhǔn)換成對(duì)應(yīng)的基因名，學(xué)名的就是基因SYMBOL。

DEG_set.result.df.fix = data.frame(gene_symbol,DEG_set.result.df)

這行代碼就是將轉(zhuǎn)換好的gene_symbol加到原來(lái)的結(jié)果文件DEG_set.result.df中，形成新的帶有基因symbol的結(jié)果文件 —— DEG_set.result.df.fix

新的結(jié)果文件

加餐：

house keeping gene矯正

先搞到house keeping gene list

下載human housekeeping gene list

如果有多個(gè)input是不是兩兩比較？

如果input不是很多那我們就進(jìn)行兩兩比較，如果比較多有十幾個(gè)那就用cuffnorm，不做顯著性差異了，用cuffnorm把大家都normalization一下 看一下某一類的基因在這十幾個(gè)樣本里面表達(dá)量的升高和降低，這是第一個(gè)分析，第二個(gè)分析是用加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析WGCNA，這也是比較常用的。
輸入的時(shí)候輸入 raw reads count 、FPKM、RSEM、TPM 都可以，但一定要保證輸入是一致的，個(gè)人建議TPM好一些。