Nat Rev | CRISPR在癌癥研究和治療中的應用

原創?驕陽似我?圖靈基因?

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撰文：驕陽似我

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本文作者帶我們詳細回顧了基因編輯技術CRISPR的發展史，并且介紹了CRISPR在不同細分領域，包括科研和臨床的重要作用。在科學研究中，CRISPR技術幫助科學家更深層次得理解癌癥和基因組的原理，在癌癥治療方面，CRISPR也展現出了非凡的創造力，同時對于CRISPER的局限性作者也進行了探討。總之作者作為導游，帶領我們在“CRISPR科學館”進行了一場圖文并茂的暢游。

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癌癥是一種復雜的疾病。從根本上說，它是一種基因組疾病，由DNA突變引起，激活致癌基因，使腫瘤抑制因子失活，以及協調正常表達的表觀基因組的失調。它也是一種細胞疾病，以新陳代謝、細胞結構和運動性的變化為食，使其能夠在不適宜的環境中生長。最終，它是一種生物體的疾病，利用正常的細胞類型和組織功能，并繞過宿主的防御系統。了解基因組的變化、細胞適應和對微環境的變化是如何驅動個體癌癥的起始、進展和治療反應的，這對于開發更有效的治療方案和改善每年數百萬癌癥診斷患者的結果至關重要。

CRISPR和CRISPR相關(Cas)蛋白是一個古老的細菌適應性免疫系統的關鍵組成部分。在過去的30年里，數百名科學家為理解CRISPR生物學和CRISPR技術的發展做出了貢獻。它已經成為一種在幾乎所有細胞類型中可編程基因組修飾的工具。

近期，在Nature reviews cancer雜志上發表了一篇名為“CRISPR in cancer biology and therapy”的綜述文章，本文的作者以其淵博的知識帶領我們了解了基因編輯技術CRISPER技術的發展史以及CRISPR在科學研究和臨床治療中的重要作用。

CRISPR是當下最熱門的基因編輯技術。最常用的CRISPER系統是化膿性鏈球菌(SpCas9)的ii型CRISPR-Cas9系統，這是一種DNA內切酶，通過可編程引導RNA(gRNA)分子(gRNA)在特定基因組位點誘導雙鏈斷裂，使CRISPR-DNA堿基配對。為了使SpCas9能夠有效地結合和切割DNA，目標序列必須在3‘側有一個“NGG”原間隔子鄰近基序(PAM)序列。Cas9創建的DSB可以通過精確的同源定向修復(HDR)解決，更常見的是通過容易出錯的非同源端連接(NHEJ)或微同源介導的末端連接(MMEJ；也稱為替代NHEJ(Alt-NHEJ))。HDR可以引入特定的變化，而可以利用NHEJ中的插入和刪除（插入）來破壞編碼和非編碼序列。

自從CRISPR系統在真核細胞中首次實施以來，變異酶的迅速擴展，擴大了基于CRISPR的平臺的能力。變異的一個來源是Cas9同源物，如金黃色葡萄球菌Cas9或其他Cas酶(例如Cas12).CRISPR不僅已成為基因編輯應用中的有用工具，而且還可以利用死亡的Cas9D10A/H840A(dCas9)研究靶向轉錄和表觀基因組機制。圖1.可應用于癌癥生物學研究的CRISPR工具的發展史

基因編輯是CRISPR最核心的技術。其重要應用主要體現在以下幾個方面：

①通過CRISPR敲除揭示基因功能。除了簡化在已建立的癌細胞系中創建簡單的基因破壞的過程外，CRISPR還能夠快速創建復雜的類器官培養物和動物模型。由于CRISPR-Cas技術的簡單性和效率，KO小鼠的生產已成為機構核心設施和商業實體的常規做法（圖2a）。創建體內KO癌癥模型的另一種策略是將所有CRISPR成分引入體細胞組織，或通過體外操作和移植培養細胞，或通過直接在體內靶向(圖2b)。除了動物模型，CRISPR結合3D培養系統的技術進步，促進了定制和基因定義的人類癌癥模型的發生，以詢問基因功能和測試新的治療方法(圖2c)。Sato和Clevers在人類結腸類器官中建立了更復雜的模型，在腺瘤性息肉病(APC)、KRAS、TP53、SMAD4和PI3Kα(PIK3CA催化亞基)中重建了多達5個不同的致癌突變(圖2d)，證明了已知或疑似驅動因素中的KO突變可導致體內腫瘤，隨后可用于研究藥物反應。

②綜合基因篩選。CRISPR在癌癥研究中影響最大的地方是綜合基因篩選。由于易于設計、克隆、效率和改進的sgRNA文庫的持續開發，使得CRISPRKO篩選成為詢問癌癥基因功能的“首選”方法。通過全基因組文庫的體外轉導和隨后的植入受體小鼠，作者的研究團隊確定了非小細胞肺癌(NSCLC)轉移的潛在調控因子(圖2e)。

③理解錯義突變。癌癥中絕大多數的突變是單核苷酸變異(SNVs)，它可能導致蛋白質功能的低、超或新形態變化。CRISPR主要在兩大方面對我們設計和研究snv的能力產生了影響。首先，通過靶向DNAdsb的能力，它增強了基于hdr的基因靶向性，其次，通過Cas融合酶，它能夠直接進行DNA修飾。圖2.應用CRISPR技術構建癌癥模型的過程

在過去的十年里，人類基因組非編碼區的一些突變與癌癥風險有關。因為這些非編碼區域包含不同的功能元件，調節致癌基因、腫瘤抑制因子和相關基因的表達。在非編碼區，CRISPR技術也有重要的作用。一些研究小組已經使用混合飽和誘變CRISPR核酸酶篩選來識別一個或多個基因周圍的必要的順式調節元件。科學家可以利用Cas9敲除靶向非編碼區，對非編碼區進行抑制或者激活。通過使用CRISPRi和CRISPRa篩選，一些研究小組已經確定了癌細胞類型特異性的非編碼突變。Engreitz和同事靶向兩個編碼癌細胞增殖轉錄因子的基因兩側區域gata1和myc，識別了9個有助于白血病細胞基因表達和細胞增殖的增強子。Gersbach和他的同事使用CRISPRi和CRISPRa來檢測了各種人類細胞系中β-球蛋白和癌基因人表皮生長因子受體2(HER2)周圍的增強子。這種策略使必要增強子(CRISPRi)和充分增強子(CRISPRa)之間得以功能區分，以促進癌基因表達，并突出細胞類型特異性增強子活性。這些研究表明，基于dcas9的工具可以揭示腫瘤特異性增強子，這可能導致新的治療策略。

圖3.各種CRISPR效應子的功能域及其在基因組規模篩選中的應用

癌癥不是單基因、單克隆或靜態性疾病。癌細胞不斷地獲得改變，從而導致復雜的遺傳和表觀遺傳學圖譜，CRISPR技術可以模擬癌癥中復雜的突變譜?？寺⊙苌镫S著癌細胞群進化成不同和不同的突變實體而發生分支和競爭，而腫瘤的細胞間組成（癌細胞、間質和免疫細胞）是非常動態，而CRISPR技術也可以追蹤腫瘤中的進化動態。了解腫瘤內的異質性和腫瘤亞克隆的出現和進化對于建立腫瘤發生的完整圖景非常重要。所以CRISPR技術特別適合于解決這些困難的問題，使研究人員能夠在細胞群中設計復雜的癌癥相關突變，并追蹤克隆進化。圖4.利用CRISPR技術進行譜系追蹤，以記錄腫瘤的異質性

多個研究小組已經表明，體外基于CRISPR的PD1靶向于T細胞可以在過繼轉移后增強抗腫瘤活性。在一項初步的臨床研究中，工程T細胞顯示出較低的脫靶編輯和最小的不良事件。在一項獨立的臨床研究中，患者T細胞使用CRISPR-Cas9grna介導的KO進行類似的工程；然而，PD1單獨或聯合內源性TCR和T細胞受體與基因組中隨機整合的相比，CAR均勻表達，增加CART細胞的效力。在人類細胞中的CRISPR編輯并非沒有問題。Cas9誘導脫靶切割，在編輯的T細胞中發現了染色體重排將CAR元件整合到CARACT細胞工程的TRAC位點；這兩種策略都有助于促進腫瘤特異性細胞毒性T細胞作為治療癌癥的免疫治療方法的抗腫瘤療效。圖5.人T細胞的體外CRISPR工程用于過繼T細胞治療

盡管CRISPR在癌癥生物學中有廣泛的應用，但其使用仍有一些局限性和關注，特別是在治療環境中。在某些情況下，這可能導致腫瘤抑制因子的丟失，并損害其他正常的細胞功能。雖然CRISPR仍然是一項相對年輕的技術，但它已經影響了癌癥生物學的幾乎所有方面，催化了大量功能數據的生成，并對一種已經被充分研究的疾病揭示了無數的新見解。然而，還有更多的東西需要學習。作者相信，在未來的5-10年里，CRISPR將邁出它在臨床醫學領域真正的第一步。

教授介紹：

Neville?E.?Sanjana博士，2001年畢業于斯坦福大學，2010?年取得麻省理工學院（腦與認知科學）博士學位。主要研究領域：基因組學、神經科學、癌癥生物學。

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Neville?E.?Sanjana的實驗室開發新技術來了解人類基因變異如何導致神經系統疾病和癌癥他的的團隊針對非編碼基因組開發了匯集CRISPR文庫和基因編輯的方法。同時他們使用多學科的方法，結合基因組工程、匯集基因篩查、生物信息學、電生理學和成像，剖析人類基因組的內部工作機制及其在自閉癥和腫瘤進化中的功能障礙。

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參考文獻：

Alyna Katti et al. CRISPR in cancer biology and therapy?[J].Nature reviews cancer. 2022 Feb 22:s41568-022-00441-w