sortmerna是一款檢測文庫中rRNA含量，并去除rRNA reads的軟件。當懷疑文庫中包含的rRNA比例較高時，這款軟件可以派上用場。以下簡單介紹它的安裝與基本使用方法。

Installation

conda install sortmerna

需要吐槽的是可以查到的官方manual還是2.1版的，作者的github也停更了...而用conda 安裝的sortmerna都已經是4.3.2了，其中有許多更改的地方

$sortmerna --version
SortMeRNA version 4.3.2
Build Date: Apr  2 2021

在官方的流程中，使用了silva 的rRNA databases作為rRNA的參考序列。silva的rRNA databases包括了古生菌、原核生物和真核生物rRNA的保守序列。你可以在以下鏈接下載rRNA database的壓縮包，包括以下文件

rRNA database:

• silva_ids_acc_tax.tar.gz
  
  
  euk：Eukarya 真核生物
  bac：Bacteria 原核生物
  arc：Archaea 古生菌

Index rRNA database

為了避免程序運行時每次都index，我們可以先對參考的rRNA databases進行index。Index完成后，以后運行程序前將idx/目錄復制到指定的workdir/目錄下即可

sortmerna --index 1 --threads 32 \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-16s-id90.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-23s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-16s-id95.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-23s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-18s-id95.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-28s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5s-database-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5.8s-database-id98.fasta \
--workdir ./

要注意的是sortmerna的運行需要指定工作目錄，默認是當前目錄。在工作目錄下，軟件會生成以下目錄

Default structure: WORKDIR/
                              idx/   (參考序列的index)
                              kvdb/  (以key-value形式存儲的比對結果)
                              out/   (輸出目錄)
                              readb/ (預處理的reads/index)

注意：在每次運行前要保證kvdb/下是空的，否則程序會報錯

參數解釋：
--ref: 參考序列fasta文件，有一個參考fasta使用一次這個參數。
--index: 程序運行的index操作，不使用這個參數的話，程序會檢測workdir/idx/下是否存在已經建好的index，沒有的話就根據--ref提供的fasta文件index。

`--index 0` 則跳過index，但若在`workdir/idx/`下沒檢測到index則會終止程序，并提醒沒有index
`--index 1` 則只進行index
`--index 2` 和默認不使用該參數一樣

去除 rRNA

以下命令對雙端測序文件進行rRNA去除，并保留雙端測序中成對的序列到兩個文件中。sortmerna會自動檢測輸入的文件類型，并保持輸出的文件類型與輸入一致，例如以下輸入.fq.gz，輸出也是.fq.gz。

sortmerna --index 0 --threads 48 \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-16s-id90.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-23s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-16s-id95.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-23s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-18s-id95.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-28s-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5s-database-id98.fasta \
--ref ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5.8s-database-id98.fasta \
--workdir ./ \
--reads NR1.fq.gz \
--reads NR2.fq.gz \
--aligned "NR/N_rRNA" --other "NR/N_clean" --paired_in --fastx --out2

參數解釋：
--reads: 輸入的序列文件(FASTA/FASTQ/FASTA.GZ/FASTQ.GZ)，如果是雙端測序就用兩次這個參數
--aligned: 比對上參考數據庫的序列，以rRNA數據庫為參考文件的話，輸出的是rRNA。這里可以包含輸出的目錄和前綴，以下是一些可行的例子

'--aligned $MYDIR/dir_1/dir_2/1' -> $MYDIR/dir_1/dir_2/1.fasta
'--aligned dir_1/apfx'           -> $PWD/dir_1/apfx.fasta
'--aligned dir_1/'               -> $PWD/aligned.fasta
'--aligned apfx'                 -> $PWD/apfx.fasta
'--aligned  (no argument)'       -> WORKDIR/out/aligned.fasta

--other: 與參考文件比對不上的序列，在這里就是rRNA-free的序列。用法與--aligned一樣
--paired_in: flag，表明輸入的文件是雙端測序文件，一端比對上就算成對的reads都比對上了。要與--fastx一起用，與--paired_out相互排斥。
--fastx: 輸出比對結果為fasta/fastq格式。
--out2: 將雙端文件單獨輸出。
--paired_out: flag，表明輸入的文件是雙端測序文件，一端比對不上的話，把成對的reads都輸出到non-aligned的文件中。要與--fastx一起用，與--paired_in相互排斥。

上面的命令輸出的結果為：

$ls NR/
N_clean_fwd.fq.gz  N_clean_rev.fq.gz  N_rRNA_fwd.fq.gz  N_rRNA.log  N_rRNA_rev.fq.gz

對于輸出的*rRNA.log我們可以關注其統計的比對結果

$cat NR/N_rRNA.log 
...
Results:
    Total reads passing E-value threshold = 181078446 (96.01) # 文庫中rRNA 含量
    Total reads failing E-value threshold = 7531112 (3.99) # 文庫中非rRNA 含量
    Minimum read length = 150
    Maximum read length = 20
    Mean read length    = 9

 Coverage by database:
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-16s-id90.fasta            0.07
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-bac-23s-id98.fasta            8.82
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-16s-id95.fasta            0.32
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-arc-23s-id98.fasta            4.92
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-18s-id95.fasta            11.53
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/silva-euk-28s-id98.fasta            70.22
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5s-database-id98.fasta         0.00
    ~/sortmerna4.3/rRNA_databases/rfam-5.8s-database-id98.fasta               0.00

其中 "Total reads passing E-value threshold = 181078446 (96.01)" 指的是輸入文件中的rRNA含量（參考序列是rRNA時），"Total reads failing E-value threshold = 7531112 (3.99)"則是非rRNA的含量。

實測如果有多個這樣的log文件也可以用multiqc生成報告。

對sortmerna軟件的簡介到此結束，使用最大的感受是這個軟件非常的費時。如果只是想大概檢測文庫中rRNA含量，可以下載相應的rRNA fasta文件，并使用現在流行的比對軟件（如STAR、Bowtie2等）進行Indexing和比對即可。這樣會快很多。以后有新的使用心得再做更新。

補充于：2021-12-02
實際上，更加方便的rRNA remove手段應該是將測序reads使用STAR、Bowtie2等方法比對到rRNA參考序列，保留unmapped reads即可。

完。

ref:
Filtering rRNA from RNAseq data: https://www.biostars.org/p/321714/
SILVA rRNA database: https://www.arb-silva.de/
https://github.com/biocore/sortmerna/